与重要疾病相关膜蛋白的结构和功能CB918800Word下载.docx
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一、研究内容
本项目将主要进行以下几方面的研究：
课题一解析在老年痴呆症中起关键作用的膜蛋白酶复合物γ-Secretase的高分辨率晶体结构，在此基础上设计它的抑制剂；
（占总经费的32.5%）
神经生物学研究证明导致奥兹海默综合症（Alzheimer’sdisease,即老年痴呆症）的重要病原之一是β-Amyloid（Aβ）多肽的积累。
Aβ来源于AmyloidPrecursorProtein（APP）。
APP经过几次剪切最终产生出Aβ，其中有两步剪切（β和γ）是在细胞膜内进行的，而执行这种膜内剪切的蛋白酶是被称为γ-Secretase的膜整合蛋白酶。
与其他膜整合蛋白酶不同的是，γ-Secretase不是一个单亚基蛋白，而是由四个亚基组成，包括Presenilin（活性位点所在亚基），Aph-1,Pen-2以及Nicastrin，四个亚基总共包含大约18个跨膜螺旋，其中Presenilin含九个，Aph-1六个，Pen-2两个，Nicastrin一个跨膜螺旋。
Presenilin在γ-Secretase组装的过程中经过剪切后形成两个紧密结合的结构域：
NTD和CTD。
其活性中心起蛋白酶水解催化作用的关键氨基酸是两个天冬氨酸（Aspartate），但其具体催化机制至今没有准确解释。
γ-Secretase不仅与老年痴呆症直接相关，而且越来越多的证据表明它可以切割诸多跨膜底物，从而被称为生物膜中的蛋白酶体。
因此解析γ-Secretase复合物的结构具有极其重要的科学价值，其受关注程度与GPCR不相上下。
根据现有科研文献报道，γ-Secretase复合物已经在昆虫细胞及CHO哺乳动物细胞两个表达体系内成功表达及纯化，并具有生物活性，但产率偏低，还不能完全满足大规模尝试结晶的需要。
美国及日本的两个实验室分别用电子显微镜观察其构象，得到了15Å
和55Å
两个低分辨率的结构。
后者由于分辨率太低，难以提取任何有实质意义的结构信息；
前者的结构分析显示γ-Secretase复合物似乎包含一个亲水性通道使它的活性位点与膜的两侧相通。
但是由于分辨率低，很难获得准确、肯定的结论。
要揭示γ-Secretase复合物的结构、工作原理以及根据结构设计其抑制剂，必须获得其高分辨率的原子水平的结构。
我们计划同时用昆虫细胞及CHO哺乳动物细胞两个体系通过共表达各个亚基来得到γ-Secretase复合物，纯化后检测其酶活性，并开始结晶的探索。
整个课题的瓶颈有两个，一是摸索合适的条件超量重组表达具有生物活性的γ-Secretase复合物；
二是摸索最优纯化条件及结晶条件。
基于我们以前摸索的膜蛋白的研究经验，我们有信心在两至三年内解决这些瓶颈问题，进而进入到晶体学实验及结构解析。
本课题中的膜蛋白还没有同源结构。
我们将结合计算生物学对这些膜蛋白进行二级结构预测，帮助重组膜蛋白的工程设计，并以此作为模型系统开发膜蛋白的三级结构预测新算法，进一步开发对膜蛋白功能及其它生物化学性质的预测。
将这些方法整合成一个膜蛋白结构预测和分析的系统平台。
我们也将同时对项目中其他课题组的目标膜蛋白进行预测分析，提供对于膜蛋白重组工程设计等方面的有利帮助，加快实验科学家对目标膜蛋白结构的实验测定。
一旦我们获得γ-Secretase复合物的结构，我们将采用成熟的分子模拟技术开展膜蛋白与配基小分子的分子对接，了解配基结合的机制，开展抑制剂的计算机辅助筛选；
开展膜蛋白与其它蛋白的相互作用研究；
利用分子动力学模拟研究膜蛋白与其它分子结合的动态过程。
通过以上计算，期望获得一些膜蛋白功能的新线索，可用于辅助实验科学家加快对目标膜蛋白的功能鉴定。
课题二解析与心血管疾病有直接关系的胆固醇代谢通路中的重要膜蛋白SCAP，INSIG，SERBP及S2P的高分辨率晶体结构，阐释膜蛋白调控胆固醇代谢通路的分子机理。
（占总经费的22.5%）
本课题包含以下几方面内容：
a.SCAP调控SREBP在细胞中定位的机理：
SREBP（SterolResponseElementBindingProtein）是一类极为特殊的转录因子[23]。
它是通过两个跨膜螺旋被固定在内质网膜上的膜整合蛋白,起转录作用的只是它的N端可溶结构域（转录因子）。
当细胞内的胆固醇含量降低的时候，这个蛋白首先要从内质网膜转移到高尔基体上，在那里它必须经过两步酶切才能将其N端可溶结构域从膜上释放出来，进而被转运到细胞核中，激活与胆固醇和脂肪酸合成、吸收相关的基因表达，从而提高体内胆固醇的含量[23]。
当细胞内的胆固醇水平足够高的时候,SREBP则被固定在内质网膜上。
控制SREBP在细胞中定位的是一个被称为SCAP（SREBPCleavageActivatingProtein）的蛋白。
SCAP的C端与SREBP的C端形成复合体,因而SCAP的细胞定位就决定了SREBP的细胞定位。
我们希望解析SCAP和SREBP复合体的结构，从而揭示SCAP调控SREBP细胞内定位的分子机理。
b.胆固醇感应蛋白SCAP受胆固醇调控的机理：
SREBP定位蛋白SCAP的N端近600个氨基酸形成了8个跨膜螺旋，其中5个螺旋组成被称为“胆固醇感应区”（SterolSensingDomain,SSD）的结构域[24]。
通过细胞和生物化学分析，已经知道这个结构域在结合胆固醇时会发生构象变化，使SCAP不能再位于内质网，而转移到高尔基体上，从而携带SREBP也定位到高尔基体[25,26]。
在那里,SREBP被两个蛋白水解酶S1P和S2P切开，从而释放出N端的转录因子进入到细胞核中，来激活一系列基因的表达。
迄今为止，我们对于SCAP这个胆固醇感应区（SSD）被胆固醇调节的机理一无所知，而要阐明这一机理，最强有力的工具就是结构生物学。
我们希望解析SCAP中胆固醇感应区单独以及与胆固醇复合物的结构，从而揭示胆固醇调节SCAP构象的原理并且设计胆固醇类似物。
该研究对发展新型降血脂的药物具有重要意义。
c.INSIG调控SCAP定位的分子机理：
INSIG（Insulin-InducedGene）包括Insig-1和Insig-2，是位于内质网膜上的整合膜蛋白，它们在胆固醇水平低的时候，与SCAP形成复合物，从而把SCAP以及与SCAP结合的SREBP“锁定”在内质网膜上；
而当胆固醇水平升高，SCAP由于胆固醇感应区构象变化，便与INSIG分离，进而脱离内质网，携带着SREBP进入到高尔基体上[27]。
我们希望解析INSIG本身以及INSIG/SCAP复合物的结构，从而揭示INSIG调节SCAP细胞定位的分子机理。
d.膜内金属蛋白酶S2P的工作机理:
在上述的SREBP经历的两步水解中，第一步水解是由高尔基体腔囊中的一个丝氨酸蛋白水解酶S1P执行的；
第二步水解格外有趣，因为切割位点位于SREBP的第二个跨膜螺旋中，即切割点是处于疏水的磷脂双层膜中。
而行使切割作用的蛋白酶是一个有着6个跨膜螺旋的膜整合蛋白S2P。
S2P在从细菌到哺乳动物的进化中高度保守，唯一的结构是由施一公教授研究组在2007年底解析的一类古细菌（M.jannaschii）中的同类物[16]。
然而仍有许多问题没有解决，比如高等生物与细菌的S2P结构是否相似；
SREBP是如何被S2P识别的；
S2P的活性是如何被调控的，等等。
我们希望解析真核生物S2P的结构，以及它与其抑制剂的结构从而回答上述问题。
e.膜蛋白的结构预测新算法开发:
本课题中的S2P已经有低级生物中的同源结构。
我们将以此作为模型系统开发膜蛋白的三级结构预测新算法，包括改进膜蛋白同源模拟中侧链的安装方法，改进膜蛋白FoldRecognition方法中弱同源性检测方法及弱同源序列比对方法；
进一步开发膜蛋白其它结构性质的预测。
将这些方法整合成一个膜蛋白结构预测和分析平台。
同时对项目组中其他实验科学家的目标膜蛋白，进行预测分析，提供关于膜蛋白结构方面的先验知识，以期帮助科学家进行有效的蛋白质工程设计，加快实验科学家对目标膜蛋白结构的实验测定。
f.膜蛋白的分子模拟:
一旦我们获得SCAP胆固醇感应区的结构，我们将采用成熟的分子模拟技术开展膜蛋白与配基小分子的分子对接，了解配基结合的机制，开展抑制剂的计算机辅助筛选；
课题三探索GPCR的结构与功能及其结构生物学研究的新技术和新方法（占总经费的22.5%）
a.使用盒式突变技术（cassettemutagenesis）获得可溶GPCR的研究：
GPCR一般由300～400个氨基酸残基组成，处于细胞外的N-末端由30-50个氨基酸组成，紧跟着的跨膜疏水区由7个α螺旋组成，位于胞内侧的C端氨基酸残基差异较大，是与G蛋白相互作用的区域。
我们拟采用渐进式的多位点突变技术，以亲水残基系统性地替换GPCR蛋白跨膜螺旋表面的多个疏水残基，改善GPCR蛋白的水溶性。
最终使跨膜结构域的疏水性质得到改变，从而获得与自然状态下在膜系统中核心蛋白形态相似、功能相同的突变GPCR蛋白。
拟选择多巴胺受体（Dopaminereceptors）作为模式系统，计划建立一个有效的GPCR家族膜蛋白可溶性表达体系，并确定一个切实可行的蛋白质工程策略。
该方法将不仅仅适用于GPCR家族蛋白的研究，它对其它膜蛋白结构与功能的研究也具有重要的、开创性意义。
b.使用融合蛋白技术（fusionprotein）稳定GPCR构象提高其结晶成功率的研究：
GPCR中的7个跨膜α螺旋由6个loop区相连，其中连接2-3、4-5和6-7α螺旋的loop区在胞外，分别称为E2、E3和E4，连接1-2、3-4和5-6α螺旋的loop区在胞内，分别称为C1、C2和C3。
比较大的C3loop区具有很大的柔性和亲水性，与C端共同负责与G蛋白的相互作用。
众所周知蛋白质分子的loop区，特别是柔性较大的loop区对蛋白质结晶是非常不利的。
美国斯坦福大学和Scripps研究所的研究组通过引入融合T4溶菌酶（T4lysozyme）的方法稳定了C3loop区并获得了2.4Å
分辨率的β2-肾上腺素受体（β2-AdrenergicReceptor）的晶体结构。
该研究结果发表在2007年11月的Science杂志上并成为2007年度世界十大科学进展之一。
显而易见，该方法的成功无论是对GPCR、还是对整个膜蛋白研究领域都产生了巨大的影响。
我们拟探索融合蛋白方法在其它GPCR结构生物学研究中的应用。
以多巴胺受体（Dopaminereceptors）作为模式系统，研究融合蛋白方法稳定GPCR膜外loop区的构象，增大蛋白质分子间特异性相互作用区域，从而改善结晶成功率。
我们拟联合使用盒式突变技术和融合蛋白技术，希望获得1-2个多巴胺受体或其它膜蛋白的晶体结构，并对其结构与功能的关系以及与之相关的潜在药物或先导化合物进行深入的研究。
课题四肺炎链球菌表面膜蛋白的结构与功能研究（占总经费的22.5%）
肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）是链球菌属革兰氏阳性菌，呈矛头状，成双排列，在痰和脓液中常形成短链状，无鞭毛，在人和动物体内可产生荚膜。
该菌经常存在于正常人的鼻腔中，当机体免疫力下降时，尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺部感染，还可引发脑膜炎、胸膜炎、菌血症和中耳炎等严重疾病。
肺炎链球菌是人类主要的致病菌之一，全世界每年约160万人因感染致病死亡。
我国每年约有250万人
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