土壤过氧化氢酶、过氧化物酶、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶测定方法.doc

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土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。

它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。

土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。

根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。

人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。

本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

二、试剂

1）甲苯

2）10%尿素：

称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：

184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：

62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：

用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：

精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。

绘制标准曲线时，再将此溶液稀释10倍供用。

三、操作步骤

标准曲线制作：

分别吸取稀释后的标准液0、1、3、5、7、9、11、13ml，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。

再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。

然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。

15min后加10ml10%尿素溶液和20mlPH6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。

培养结束后过滤，过滤后取3ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

1h内在分光光度计与578nm波长处比色。

注意事项:

1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算：

脲酶活性以24小时后5g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。

NH3－N=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：

a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

V为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；

m表示烘干土重

土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）

一、原理

测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。

前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。

研究证明：

磷酸酶有三种最适PH值：

4~5、6~7、8~10。

因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。

测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。

磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠等。

现介绍磷酸苯二钠比色法。

二、试剂

1）缓冲液：

a.醋酸盐缓冲液PH5.0

0.2mol/L醋酸溶液:

11.55ml95%冰醋酸溶至1L.

0.2mol/L醋酸钠溶液:

16.4gC2H3O2Na或27gC2H3O2Na.3H2O溶至1L。

或者取14.8ml0.2mol/L醋酸溶液和35.2ml0.2mol/L醋酸钠溶液稀释至1L.

b.柠檬酸盐缓冲液PH7.0

0.1mol/L柠檬酸溶液：

19.2gC6H7O8溶至1L.

0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：

53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7gNa2HPO4.12H2O溶至1L.

取6.4ml0.1mol/L柠檬酸溶液加43.6ml0.2mol/L磷酸氢二钠溶液稀释至100ml.

c.硼酸盐缓冲液PH9.6

0.05mol/L硼砂溶液19.05g硼砂溶至1L.

0.2mol/LNaOH溶液8gNaOH溶至1L.

取50ml0.05mol/L硼砂溶液加23ml0.2mol/LNaOH溶液稀释至200ml.

2）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）

3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：

称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml95%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

4）甲苯

5）0.3%硫酸铝溶液

6）酚标准溶液

酚原液：

取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。

酚工作液（0.01mg/ml）：

取10ml酚原液稀释至1L。

7）PH9.4硼酸缓冲液

0.2mol/L硼酸：

12.37g硼酸加水溶解稀释至1000ml

0.05mol/L硼砂：

19.07g硼砂加水溶解稀释至1000ml

取800ml硼砂溶液加200ml硼酸溶液混合即为PH9.4硼酸缓冲液。

三、操作步骤

标准曲线绘制：

取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5mlPH9.4硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度。

30min后，在分光光度计上660nm处比色。

以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

称2g土样置于200ml三角瓶中，加5滴甲苯，轻摇15min后，加入20ml0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37℃下培养24h。

然后在培养液加入40ml0.3%硫酸铝溶液并过滤。

吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。

用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm处比色。

注意事项:

1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算

以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。

磷酸酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：

a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

V为显色液体积；

n为分取倍数；

m表示烘干土重

土壤蔗糖酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法）

一、原理

蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关。

一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。

蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。

二、试剂

1）8%蔗糖溶液

2）PH5.5磷酸缓冲溶：

1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。

3）甲苯

4）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）

称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。

5）标准葡萄糖溶液：

预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。

准确称取0.5g葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至100mL容量瓶中，定容，摇匀。

即为5mg还原糖/mg的溶液。

冰箱中4℃保存期约一星期，若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

三、操作步骤

（1）标准曲线绘制

分别吸葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温。

将溶液转移至100ml容量瓶中，定容。

以空白管调零在波长508nm处比色，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

（2）土壤蔗糖酶测定

称取2g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。

摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。

到时取出，迅速过滤。

从中吸取滤液1ml，注入小试管中，加3mlDNS试剂，在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将试管移至自来水流下冷却3min。

溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后将试管内液体转移至100ml容量瓶中，并用蒸馏水定容稀释至100ml。

在分光光度计上于508nm处进行比色。

为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。

四、结果计算：

蔗糖酶活性以24h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。

蔗糖酶活性=（a样品－a无土－a无基质）*V*n/m

a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；

V为显色体积；

n为分取倍数；

m为土重。

过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）

一、原理

过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。

与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H2O2→H2O+O2），从而降低了过氧化氢的毒害作用。

土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。

测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：

根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法：

根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性；滴定法：

用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。

本实验重点采用高锰酸钾滴定法。

二、试剂

1.5mol/LH2SO4溶液:

量取42ml浓硫酸稀释至500ml；

0.3%的H2O2：

将30%双氧水稀释100倍，其浓度用高锰酸钾滴定；

饱和明矾溶液：

铝钾矾即明矾在20℃的溶解度为10.84g，30℃的溶解度为15.41g；

0.02mol/L高锰酸钾：

称取3.16g高锰酸钾溶解定容至1L，其准确浓度用草酸钠标定；

三、操作步骤

分别取2g土壤样品于三角瓶中，加入40ml蒸馏水，加