苏州大学现在分子生物学.docx

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苏州大学现在分子生物学

现代分子生物学

第一章

DNA的发现：

1928年，英国Griffith的体内转化实验

1944年，Avery的体外转化实验

1952年，Hershey和Chase的噬菌体转导实验

分子生物学主要研究内容（p11）

DNA的重组技术

基因表达调控研究

生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学

基因组，功能基因组与生物信息学研究

第二章

DNARNA组成

脱氧核糖核酸ATGC

核糖核酸AUGC

原核生物DNA的主要特征

①一般只有一条染色体且带有单拷贝基因；

②整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列组成；

③几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。

染色体作为遗传物质的特点：

（1）分子结构相对稳定（贮存遗传信息）

（2）通过自我复制使前后代保持连续性（传递遗传信息）

（3）通过指导蛋白质合成控制生物状态（表达遗传信息）

（4）引起生物遗传的变异（改变遗传信息）

C值以及C值反常

C值单倍体基因组DNA的总量

C值反常C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却有较大的C值。

如果这些DNA都是编码蛋白质的功能基因，那么，很难想象在两个相近的物种中，他们的基因数目会相差100倍，由此推断，许多DNA序列可能不编码蛋白质，是没有生理功能的。

DNA的中度重复序列，高度重复序列

中度各种rRNA，tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因都属于这一类

高度卫星DNA

核小体

是由H2AH2BH3H4各2分子生成的八聚体和约200bp的DNA构成的，H1在核小体外面。

真核生物基因组的结构特点

①基因组庞大；

②大量重复序列；

③大部分为非编码序列，90％以上；

④转录产物为单顺反子；

⑤断裂基因；

⑥大量的顺式作用元件；

⑦DNA多态性：

SNP和串联重复序列多态性；

⑧端粒（telomere）结构。

DNA的一级结构，二级结构

一级机构

指构成核酸的四种基本组成单位--脱氧核糖核苷酸（核苷酸）的连接和排列顺序，表示了该DNA分子的化学组成。

DNA一级结构基本特点

①DNA由2条相互平行的脱氧核苷酸盘绕而成；

②DNA分子中的脱氧核糖和磷酸连接，排列在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧；

③两条链的碱基按照碱基互补配对原则通过氢键结合形成碱基对。

DNA的二级结构

定义：

指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所组成的双螺旋结构。

两条相同、反向结合、碱基互补配对、氢键

分类：

根据DNA双螺旋结构螺距和旋转方向不同，可以分为B-DNA,A-DNA,Z-DNA等

半保留复制：

DNA在复制前氢键断裂，双螺旋解旋并分开，每一条作为合成新链的模板，按碱基配对的规则产生互补的两条链。

因此子代DNA双链中一条是原来的链，另一条是新合成的。

复制子（replicon）:

DNA复制时，并不是整条链全部打开，而是在复制的局部将链打开，形成复制单位。

即从起始位点到终止位点的全部DNA。

复制叉（replicationfork）：

DNA分子在复制时，在复制起始位点两条链解开成单链，各自作为模板合成互补链，所以这个复制起点呈现叉子的形式。

环状DNA的复制

⑴θ型

⑵滚环型（rollingcycle）

⑶D-环型（D-loop）

原核生物DNA复制的特点：

最小复制起始位点：

一段245bp的序列，3个13聚体的回文结构＋4个9聚体的重复序列（复制起始蛋白结合位点）。

原核DNA复制的过程：

1、DNA双螺旋的解旋

⑴解旋酶（helicase）：

dnaB编码的DnaB，通过水解ATP获得能量，沿5’→3’方向解开DNA双链。

（Rep3’→5’）

⑵单链DNA结合蛋白（SSB）：

能结合并覆盖在单链DNA上，防止解开的DNA单链被酶降解以及重新结合成双链，以保持单链的存在。

原核生物SSB具“协同作用”。

⑶DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）：

催化DNA断裂和重新连接。

2、DNA复制的引发

引发酶：

引物合成。

DNA聚合酶不能引发DNA新生链的合成，先由引发酶催化合成RNA引物，DNA聚合酶再从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。

后随链：

引发前体（6种蛋白组成）＋引发酶组成引发体，发挥功效。

3、冈崎片段与半不连续复制

半不连续复制（semidiscontinuousreplication）：

DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。

DNA复制时，DNA聚合酶合成方向都是5’→3’方向延伸。

合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为先导链（领头链）；合成方向与复制叉移动的方向相反，先按5’→3’顺序合成一短DNA（冈崎片段），再连成一条完整的DNA链为滞后链（随从链）。

4、复制的终止

复制终止子序列（Ter）：

特定终止区域，Ter-tus复合物使DnaB不再解链，阻挡复制叉前移。

5、DNA聚合酶

以DNA为模板的DNA合成酶

以四种dNTP为底物

反应需要有模板的指导

Mg2+存在

反应需要有3'-OH存在

DNA链的合成方向为5'→3'

原核生物DNA聚合酶的作用

DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）：

在修复中起作用

DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）：

修复DNA

DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）：

DNA的真正复制酶

真核生物DNA复制的特点

1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子

2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制（多复制叉）。

真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。

3、真核生物有多种DNA聚合酶。

真核生物DNA聚合酶

α：

复制，还具有引物酶活性，后滞链的合成

β：

修复作用，在DNA链上加上一个核苷酸

γ：

线粒体DNA复制中起作用

δ：

复制主要的酶。

先导链合成，行进距离大

ε：

后随链合成有关

DNA损伤的修复

1错配修复

2切除修复

3重组修复

4DNA的直接修复

5SOS反应

原核转座子：

①IS－两端有ITR，只编码转座酶

②复合转座子－两端有IS或类IS，编码抗生素

③TnA转座子－两端有ITR，可编码转座酶、解离酶、抗性物质。

插入序列（insertionsequence，IS）

（1）是一类较小的没有表型效应的转座因子，长度约750~1500bp；λ:

:

IS1

（2）由一个转位酶基因和两侧的反向重复序列组成；

（3）可双向插入靶位点，在插入后的两侧可形成正向重复序列

复合转座子（copmpositetransposon）

①是一类较大的可移动成分；

②中心区域含有关转座的基因，如转座酶；

③带有一个或几个与转座作用无关的但可决定宿主菌遗传性状的基因，如大肠杆菌毒素Ⅰ基因、抗药性基因等。

转座子A家族（transposonA,TnA）

不仅编码抗性标记基因，还编码转座酶和解离酶。

解离需要一个特异性的内部部位，这是TnA族的重要特征。

转座作用机制

①复制型转座（replicativetransposition）

②非复制型转座（nonreplicativetransposition）

③保守性转座（conservativetransposition）

第三章

编码链，正义链，模板链，反义链（知道图上的位置）

作为模板进行转录的DNA链称为模板链、反义链或负链；

而以模板相对的那条链称为编码链、有义链或正链。

转录的基本过程

1模板识别

模板识别：

指RNA聚合酶与启动子DNA相互识别并结合的过程。

启动子（promoter）：

基因表达调控的顺式作用元件，为基因转录起始所必需的。

真核生物：

还需转录调控因子参与

2转录起始

转录起始：

不需引物。

RNA聚合酶与非特异性结合位点相结合→聚合酶与启动子区闭合双链DNA相结合→二元闭链复合物→二元开链复合物→开始转录。

原核生物的转录起始

1、RNA聚合酶全酶（α2'ββσ）与模板结合

2、DNA双链解开,形成转录空泡

3、在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应

5’-pppG-OH+NTP→5’-pppG-OH+NTP

起始复合物:

RNApol-DNA-pppGpN-OH

3转录延伸

RNA聚合酶释放σ因子，核心酶沿模板链移动并使新生RNA链不断延长。

1、σ亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；

2、在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。

4转录终止

转录终止：

RNA链延伸到转录终止位点，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合链分离，转录泡瓦解，DNA恢复双链状态，RNA聚合酶、RNA链被释放。

RNA聚合酶

σ因子：

蛋白因子，负责模板链的选择和转录的起始，使全酶专一性

识别模板上的启动子。

全酶核心酶：

①依靠酸性蛋白和碱性核酸的静电引力与DNA松弛结合。

②负责转录由全酶识别并形成单链DNA的模板。

σ因子：

负责模板链的选择和转录的起始，使酶专一性识别模板上的启动子。

✓提高聚合酶对DNA的亲和力

✓降低聚合酶对模板DNA上非特异性位点的结合常数

DNA聚合酶

对α-鹅膏蕈碱的敏感程度

在细胞中存在部位

合成RNA

酶Ⅰ

基本不受影响，>10-3mol/L才轻微抑制

核仁

5.8S、18S、28SrRNA

酶Ⅱ

最为敏感，10-8～10-9mol/L即抑制

核质

mRNA

酶Ⅲ

介于上述2个中间

核质

tRNA、5SrRNA、snRNA

启动子（promoter，promotor）：

与基因表达启动相关的顺式作用元件，是结构基因的重要成分。

它是一段位于结构基因5’端上游100-200bp的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。

启动子特征：

①序列特异性。

含保守序列框。

②方向性。

是一种有方向性的顺式调控元件

③位置特异性。

位于所启动转录基因的上游或前端

④种属特异性。

不同种、属，不同组织均不同

原核生物

Pribnow框（-10区）：

在原核生物基因的-10（-4~-13）序列区存在的一段有助于dsDNA局部双链解开的保守序列5’TATAAT3’。

Pribnow框是RNA聚合酶的牢固结合位点。

Sextama框（-35区）

在-35bp前后有一个保守的TTGACA序列，是RNA聚合酶初始结合位点。

RNA聚合酶依靠σ因子识别该位点，又称为识别位点。

-35区在很大程度上还决定启动子强度（结合速度）；-10序列区，通过影响开链式启动子复合物的形成速度而控制转录（解链速度）。

真核生物

TATA框：

又称Hogness框：

中心位置在-25（-20~-30）之间存在的TATA（A/T）A（A/T）区，与DNA双链解开有关，并决定转录起始位点。

功能与原核生物的Pribnow框类似。

CAAT框：

-75附近，GGC/TCAATCT，可能控制转录起始的频率，与Sextama框功能类似，与RNA聚合酶结合有关。

正反取向均能发挥作用。

GC框：

-90，GGGCGG，可能为转录因子的结合序列。

影响转录频率。

八聚体框（octamerbox）：

ATGCAAAT，影响转录频率。

增强子（enhancer）：

①远距离效应：

②无方向性，行使功能与所处的位置、取向无关：

上、下游中；双向都能起作用

③顺式调节：

只调节位于同一染色体上的靶基因

④无物种和基因特异性：

不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能

⑤具组织特异性：

增强子效应需特定蛋白因子参与

⑥还受外部信号的调控：

原核真核的mRNA特征比较

原核

1、半衰期短

2、多以多顺反子形式存在

3、5’端无帽子结构，3’端无poly（A）结构，有SD序列

真核

1、5’端帽子结构；

2、3’端poly（A）结构

SD序列

在原核生物结构基因起译密码子上游10bp（7-12bp）处，有一个富含嘌呤的序列,转录出mRNA上5’-AGGAGGU-3’，与核糖体30S亚基的16SrRNA3’端3’-UCCUCCA-5’互补，成为30S亚基识别和结合mRNA的位点。

转录的终止

1、不依赖于ρ因子的终止（强终止子）：

①发卡结构：

GC丰富区域；②poly（U）结构：

与DNA上poly（A）作用力较弱，新生链易从模板上脱落。

2、依赖ρ因子的终止（弱终止子）：

ρ因子是一种NTP酶，由于催化了NTP的水解因而能促使新生链从三元复合物中解离而终止转录。

RNA剪接（RNAsplicing）：

从mRNA前体分子中切除被称为内含子的非编码区，并使基因中被称为外显子的编码区拼接形成成熟mRNA

RNA编辑（RNAediting）：

指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入、丢失或转换现象，从而改变蛋白的结构信息

核酶（ribozyme）

具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。

GU—AC法则见书P95

第四章

起始密码子

AUG（同时为甲硫氨酸的密码子）

终止密码子

UAA（赭石）、UAG（琥珀）、UGA（蛋白石）

遗传密码的性质

1、密码的连续性（无标点符号）：

无间断也无重叠

2、密码的简并性（degeneracy）：

61个密码子代表20个氨基酸。

除了甲硫氨酸（AUG）和色氨酸（UGG）外，其它氨基酸都对应一个以上密码子。

3、遗传密码的通用性（universality）与特殊性

4、密码子与反密码子的相互作用

碱基摆动配对（wobblebase-pairing）：

P115

密码子的第三个碱基总是处在一个不稳定的位置上，它与反密码子的第一个碱基配对结合的强度不如前两个碱基。

结果是tRNA可以和一个以上的密码子碱基配对。

三叶草型的二维结构

1、受体臂（acceptorarm）或称氨基酸臂：

携带特异氨基酸。

2、TψC臂：

和核糖体上的rRNA识别结合。

3、反密码子臂（anticodonarm）：

密码子的识别与配对。

4、D环臂（Darm），或双氢尿嘧啶环:

与氨基酰tRNA合成酶结合。

5、额外环（extraarm）：

L型三维结构中连接两个区域（D环-反密码子环和TψC-受体臂）。

同工tRNA（cognatetRNA）：

携带不同的反密码子，但能识别同一氨基酸多个密码子的tRNA。

它们的相对丰度决定了密码子的选择性利用率。

tRNA的种类

1、起始tRNA和延伸tRNA

原核生物：

甲酰甲硫氨酸（fMet）

真核生物：

甲硫氨酸（Met）

2、同工tRNA（cognatetRNA）

3、校正tRNA

无义突变（nonsensemutation）

在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子，使蛋白质的合成提前终止，合成物功能的或无意义的多肽，这种突变称为无义突变

错义突变（missensemutation）

通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质

核糖体的结构

蛋白质合成的生物学机制（须具体掌握见书）

1氨基酸的活化

2翻译的起始

3肽链的延伸

4肽链的终止

5蛋白质前体的加工

6蛋白质的折叠

7蛋白质合成的抑制剂

分子伴侣（molecularchaperone）：

能防止新生链错误缠绕、促进肽链正确折叠的蛋白质。

是细胞内蛋白质折叠和组装的重要调节者，能与其它构象不稳定的蛋白结合并使之稳定地一类蛋白质。

具体功能：

①封闭暴露出来的疏水区段，保护蛋白质不受其它蛋白的相互作用，利于蛋白质正确折叠；

②防止新生肽链在折叠前相互聚合；

③识别错误折叠的变性蛋白，帮助其复性。

信号肽与蛋白质转运

①蛋白质转运必须完整的信号肽序列；

②仅有信号肽序列蛋白质不一定转运；

③信号肽切除不一定抑制转运；

④转运蛋白质不都含有可降解的信号肽。

蛋白质的靶向（proteintargeting）：

细胞中新合成的蛋白质必须被分选和运送到特定的亚细胞结构中定位或分泌至细胞外以发挥它们的特定功能。

信号肽序列：

决定蛋白质定位的信息，在起始密码子后编码疏水氨基酸的序列。

特点：

①10-15个疏水氨基酸

②N端1或数个带正电荷的氨基酸（碱性氨基酸）

③C端有数个极性氨基酸，最后的丙氨酸或甘氨酸

核定位序列（重要功能见书P150）

核蛋白的重复定位

第五章

DNA的历史回顾（见书）

核酸凝胶电泳技术原理和过程

糖-磷酸骨架在结构上重复，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。

在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。

核酸电泳的指示剂：

溴酚蓝呈蓝紫色，二甲苯青呈蓝色。

核酸电泳的染色剂：

溴化乙锭（EB）

过程

1、凝胶准备用0.5×TBE配制1％琼脂糖凝胶。

①称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml0.5×TBE

②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖；电炉

③熔化的琼脂糖自然冷却到60度（可加入EB）

2、胶床准备

①将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙

②将胶床放在调整好的水平台上

3、铺胶将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm

4、室温下静置半小时左右，凝胶固化。

将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极

5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可

6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。

原梳齿处（样品孔）即被缓冲液充满，如发现

有气泡，应设法去除（可在步骤4时进行）

7、样品准备：

向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀

细菌转化（transformation）：

指一种细菌菌株捕获了来自供体菌的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。

◆原理：

将对数生长期的细菌在0℃下,用预冷的CaCl2溶液低渗处理，使菌体的细胞壁和细胞膜通透性增加，菌体膨胀成球形，外源DNA可形成复合物而被吸附；经短暂42℃热休克，DNA易于进入细菌的细胞内而不被降解。

转化效率达105-106个转化子/ugDNA。

过程

（1）感受态细菌的制备

Ø接种一环DH5α于2mlLB中→37℃，振荡过夜以约1%的接种量接入50mlLB中→振荡培养约90’至OD600≈0.2→冰浴10～60min→离心（5K，5’）→收集菌体→加入预冷CaCl2（30ml100mM）→冰浴20’→离心收集菌体→加入2ml100mM预冷CaCl2混匀→感受态细胞。

（2）转化

✶冰浴30’→42℃90s（热休克）→冰浴，2’→加37℃预热LB培养45’→取100ul/皿涂布抗性平板→37℃倒置培养过夜→检查细菌生长情况。

（3）阳性克隆筛选

☐抗药性筛选

☐蓝白斑筛选

☐PCR筛选

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）：

是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。

PCR一般反应过程是：

Ø变性：

94℃；

Ø复性（退火）：

50-60℃；

Ø延伸：

72℃，耐热性DNA聚合酶

基因组文库:

某种生物基因组的全部遗传信息的集合。

将某个生物的基因组DNA片段与载体在体外重组，转化宿主细胞所得的菌落或噬菌体的集合。

cDNA文库的构建过程（见书）

SNP：

singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸突变引起的多态性。

第三代遗传标志。

第六章

荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）

它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体或DNA上特异序列杂交，通过与荧光分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列的位置。

酵母单杂交系统：

是用于研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。

酵母双杂交系统：

用于检测细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。

现不仅局限于检测已知蛋白间的相互作用，也可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。

荧光共振能量转移法（FRET）荧光能量转移有三个基本条件：

1给体与受体在合适的距离（1～10nm）；

2给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠；

③给体与受体的偶极具有一定的空间取向。

smallinterferingRNA（siRNA）：

是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），与mRNA的互补区发生碱基配对作用，阻遏其表达。

具有这种作用的短小单链RNA称～。

这种作用称RNA干扰（RNAinterference，RNAi）。

第七章

葡萄糖效应或降解物抑制作用

Ø在葡萄糖存在的情况下，即使在培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶。

Ø原因：

葡萄糖是最方便的能源，无需开启不常用的基因。

应急反应

氨基酸饥饿时，会出现大量的空载tRNA，激活焦磷酸转移酶，生成鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），魔斑核苷酸。

乳糖操纵子详见PPT

乳糖操纵子的负调控

☐缺乏乳糖时，阻遏蛋白以活性状态结合在lcaO上，影响了RNA聚合酶与lacP的结合，并阻碍RNA聚合酶通过lacO，基因无法转录。

☐乳糖存在时，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，改变了构象，脱离lacO，RNA聚合酶可与lacP结合，开始转录。

乳糖操纵子的正调节控制

☐正调控蛋白：

代谢物基因激活蛋白，CAP（cataboliteactivatorprotein）或CRP（cyclicAMPreceptorprotein）：

crp基因编码的两个相同亚基组成的二聚体。

☐CAP亚基有2个结构域：

氨基末端与cAMP结合，羧基末端和DNA结合。

☐lacP转录起始需要CAP存在，该蛋白只有在cAMP存在时才有活性。

cAMP与CAP结合后，构象变化，对DNA亲和力增大。

－－CAP正调控因子。

色氨酸操纵子（Trp）详见ppt

5个结构基因：

•trpE、trpG：

编码邻氨基苯甲酸合成酶

•trpF：

异构酶

•trpD:

编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶

•trpC：

编码吲哚甘油磷酸合成酶

•trpB、trpA：

编码色氨酸合成酶的βα亚基

前导区：

trpL；弱化子：

trpa（前导区的123－150位）

阻遏调节系统

☐①当培养基中缺乏组氨酸时，阻遏蛋白不被激活，不能与trpO结合，RNA聚合酶结合于启动子，操纵子表达；

☐②当培养基中存在色氨酸时，阻遏蛋白与辅阻遏物（色氨酸）结合后与trpO结合，阻止转录的进行。

●所以色氨酸操纵子是负调控阻遏系统；不受CAP-cAMP的影响。

－－与lac操纵子区别。

调控方式

阻遏作用：

指激活的trp阻遏蛋白与trpO结合，使转录不能起始。

－－环境