不同渐渗片段聚合对产量品质的影响分析.docx
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不同渐渗片段聚合对产量品质的影响分析
ANYANGINSTITUTEOFTECHNOLOGY
本科毕业论文
不同渐渗片段聚合对产量品质的影响分析
DifferentSegmentsofIntrogressiveAggregationEffectonCottonProductionQualityAnalysis
学院名称：
生物与食品工程学院
专业班级：
2009级生物技术
学生姓名：
王振平
学号：
200906060012
指导教师姓名：
卢全伟
指导教师职称：
讲师
2013年5月
毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明
原创性声明
本人郑重承诺：
所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。
尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得安阳工学院及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。
对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。
作者签名：
日 期：
指导教师签名：
日 期：
使用授权说明
本人完全了解安阳工学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：
按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。
作者签名：
日 期：
目录
中文摘要、关键词I
英文摘要、关键词II
引言1
第1章材料与方法3
1.1试验材料3
1.1.1材料的选择3
1.1.2材料的获取3
1.2基因组DNA提取3
1.3SSR分子标记技术5
1.3.1SSR分子标记5
1.3.2PCR扩增6
1.4数据分析7
第2章结果与分析9
2.1SSR结果9
2.2渐渗片段聚合分析9
2.2.1描述性统计9
2.2.2相关性分析10
2.2.3正态分布分析11
2.3产量性状分子标记辅助选择效果分析13
2.3.1单标记辅助选择效果检测标记13
2.3.2两个不同位点QTLs聚合效果检测15
第3章讨 论16
3.1染色体片段代换系16
3.1.1理想的染色体片段代换系16
3.1.2染色体片段代换系的特点16
3.2分子标记辅助选择16
3.3QTL与QTL间的互作效应16
3.4影响分子标记辅助选择检测效果的因素17
3.4.1背景材料及QTL互作的影响17
3.4.2尚未检测的QTL的影响问题17
3.4.3分组群体大小17
3.5分子标记辅助选择前景展望17
结论19
参考文献20
致谢22
不同渐渗片段聚合对棉花产量品质的影响分析
摘要：
利用生产上推广的优良早熟陆地棉栽培品种中棉所36为受体亲本、海岛棉海1为供体亲本，构建一套渐渗有海1染色体片段的代换系群体BC5F3，并从其中选取4个纤维品质优良、在不同环境遗传稳定、渐渗片段较少的亲本材料通过单交、双交配制双交组合，进一步研究不同渐渗片段聚合对棉花产量性状影响。
结果显示，在单标记辅助选择中，选出了5对与产量显著相关的标记，其中4对位于第20号染色体上，1对位于第8号染色体上，均与部分产量性状显著相关。
在双标记辅助选择中，分析了两组标记，一组标记均位于第20号染色体上，当两个标记都聚合时，比聚合任何一个效果都好，只聚合一个时，反而不如单标记效果好；另一组标记，分别位于20号和8号染色体上，分析表明，无论聚合2个标记还是只聚合1个效果都不如单标记好。
关键词：
棉花渐渗系分子标记辅助选择QTL定位聚合纤维产量
DifferentSegmentsofIntrogressiveAggregationEffectonCottonProductionQualityAnalysis
Abstract：
Thistestusingtheproductiononthepromotionofgoodearlyuplandcottoncultivarsofcotton36forreceptorparent,seaislandcotton1asthedonorparent,hasbuiltasetofintrogressiveBC5F3sea1chromosomesegmentsubstitutionisgroup,andfourfromtheselectionofthefiberareofgoodquality,andgeneticstabilityindifferentenvironment,segmentsofintrogressivelessparentalmaterialsbysinglecrossanddouble/compounddoublecrosscombination,furtherstudyondifferentsegmentsofintrogressiveaggregationeffectoncottonyield.,accordingtotheresultsinthesinglemarkerassistedselection,choosethe5weresignificantlyassociatedwithproductionoftag,includingfourinchromosome20,onchromosome1in8,areassociatedwithasignificantportionoftheyieldcharacters.Indoublemarkerassistedselection,twosetsoftagsareanalyzed,asetoftagsarelocatedonchromosome20,whentwotagsareaggregation,thananyoneaggregationeffectisgood,justa,itisbetterthansinglemarkereffectisgood;Anothersetoftags,locatedonchromosome8and20respectivelyanalysisshowedthatthepolymerization2tagsoraggregatedoneeffectisnotasgoodassingletag.
Keywords：
CottonDepartmentofintrogressiveMarker-assistedselectionQTLmappingThefiberproducution
引言
棉花是世界上重要的天然纤维作物，我国是世界棉花的主产国家，在我国国民经济中占有重要地位。
通过多年的资源引进与育种研究，我国的棉花单产得到一定提高，品质也有所改善。
但我国棉花遗产基础普遍比较狭窄，棉属种间遗传多样性高，陆地棉品种见得遗传多样性低，遗传基础狭窄，利用多种途径改善陆地棉的遗传多样性是棉花种质资源工作的重要内容。
棉花的大多数性状,特别是那些与产量、品质等有关的性状一般是由多基因控制的数量性状（quantitativetrait），从育种的角度讲，对数量性状的遗传操纵能力决定了育种的效率。
由于数量性状受多基因控制，遗传基础复杂，易受环境影响，表现为连续变异，且表现型与基因型之间没有明确的对应关系，因此，对数量性状的遗传研究十分困难，导致数量性状的遗传研究远远落后于质量性状，限制了数量性状在作物遗传改良中的应用。
传统的改良方法在棉花品种[1]改良中效率低，周期长，且无法确定单个数量性状位点在染色体上的具体位置。
随着分子生物学的快速发展，出现了DNA分子标记技术，为育种工作者提供了一种快速、准确的选择方法，利用分子标记遗传连锁图，棉花的许多QTLs已被定位在染色体的特定区段。
与以往遗传标记相比，DNA分子标记具有很多无可比拟的优越性：
不受环境的影响，在生物发育的不同阶段和不同组织的DNA都可用于标记分析；生物基因组变异丰富，分子标记数量多；表现中性，目标性状不受影响；大多分子标记呈共显性，可用于鉴定杂合与纯合基因型个体；检测方法简单、迅速，节省人力。
目前，DNA分子标记技术已广泛应用于作物遗传图谱构建、重要性状基因或QTL定位、品种指纹图谱和纯度鉴定、种质资源遗传多样性分析以及分子标记辅助选择[2]（Molecularmarkerassistedselection，MAS）育种等科学研究中。
染色体片段代换系[3]（ChromosomeSegmentSubstitutionLines，CSSLs），即渐渗系，是指通过高代回交并自交，借助分子标记辅助选择获得的一套具有受体亲本背景并渐渗有一个或几个小的供体亲本染色体片段的群体。
导入系和由导入系发展而来的染色体单片段代换系[4]（Singlechromosomesegmentssubstitutionlines）由于基因组绝大部分区段与轮回亲本相同,仅含少数或单个供体亲本的染色体片段,因而导入系和轮回亲本的任何表型差异都是由导入片段引起的,最大限度排除了遗传背景与基因间的干扰,是对QTL进行精细定位与克隆的良好材料。
CSSLs的特点是：
遗传背景单一性，每个CSSL的基因组只渐渗有一到几7个供体亲本的染色体片段，大部分背景与轮回亲本相同，遗传背景简单，提高QTL定位的精确度；稳定性，CSSLs是永久性分离群体，可以进行多年、多点、多重复的实验，研究QTL的稳定性；可分割性，CSSLs的代换片段可通过回交或者重组的方法再分割成长度更短的片段。
构建CSSLs的方法是通过杂交后高代回交，并结合分子标记辅助选择进行培育。
具体试验步骤是：
选择所要研究的两个表型差异比较大的受体亲本和供体亲本杂交形成F1，F1与受体亲本进行多代回交并自交，在早代回交群体中，利用分子标记辅助选择，选留符合要求的个体，最终构建成一套染色体片段代换系。
高密度的分子标记[5]遗传连锁图可将数量性状分解为单个孟德尔因子进行分析,从而确定QTL在染色体上的位置及各种遗传效应[6]。
QTL定位常用分离群体，包括F2/F2:
3、BC1、DH、RILs等，这些分离群体的遗传背景复杂，对遗传效应的干扰比较严重，造成QTL定位准确性不高。
利用杂交、高代回交[7]并结合分子标记辅助选择构建的染色体片段代换系，背景简单，基本与轮回亲本相同，基因组只含有一个或几个小的供体亲本的染色体片段，可用于进行多年多点多环境的重复试验，利用此群体进行QTL检测[8]，可有效减少遗传背景干扰，提高QTL定位的准确度，是研究QTL的理想材料[9]。
本研究正是基于上述这种状况，并在前人研究的基础上，就如何提高棉花产量而做出以下实验方案，以生产上大面积推广的早熟陆地棉中棉所36为轮回亲本和海岛棉海1为供体亲本构建染色体片段代换系，实现海岛棉优良特性基因向陆地棉的渐渗，获得具有稳定的纤维品质优良的CSSLs材料；并从这套代换系中选取4个纤维品质优良、在不同环境中遗传稳定、渐渗片段较少的材料作为亲本，通过单交、双交配制双交组合，进行下一步棉花聚合育种；筛选染色体单片段代换系，进行精细定位基因，这对创制优异棉花新材料具有十分重要的意义。
第1章材料与方法
1.1试验材料
1.1.1材料的选择
试验材料的亲本为陆地棉品种中棉所36和海岛棉新品系海1，其中轮回亲本中棉所36是中国农业科学院棉花研究所培育的品种，具高产早熟特性，纤维品质一般；供体亲本海1具有优良纤维品质、高抗黄萎病，晚熟，产量较低，为显性无腺体材料[10]。
组配陆海杂交组合，利用中棉所36为轮回亲本进行回交，通过分子标记辅助选择，构建染色体片段代换系，从中选取4个（9125765、9125770、9125772和9125776）纤维品质优良、在不同环境遗传稳定、渐渗片段较少的亲本材料，通过单交、双交配制双交组合。
1.1.2材料的获取
本研究所在课题组自2003年至2007年以中棉所36为轮回亲本，以海1为供体亲本构建了一套染色体片段代换系，经过两年自交，2009年在河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验地种植了BC5F3家系（染色体片段代换系）世代（约2660个单株），每隔20行种植中棉所36（对照）1行。
2009年4月26号播种，5米行长，0.8米行距，苗期拔除有腺体植株，定苗株距为0.25-0.26米；提取单株总DNA，按单株收取自然铃。
按家系挑选了658个BC5F3单株（每个家系挑选4-5株），于2010年在河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验地种植，获得了658个BC5F3:
4株行，每隔20行种植1行中棉所36为对照。
2010年4月27号播种，地膜覆盖，5米行长，0.8米行距，定苗株距为0.25-0.26米，6月20号去膜；按株行收取30铃进行产量品质的初步评价，筛选出408个株系进行多环境综合评价[11]，2011年于中国农业科学院棉花研究所试验地（河南安阳）种植BC5F3:
5株系，每隔20个材料种植中棉所36对照，采用两重复，单行区试验，行长5米。
2012年将选取的4个亲本材料种植于河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验地，每个亲本种2行，每行20株，5米行长；双杂交F1代种20行，每行20株。
田间管理同大田。
1.2基因组DNA提取
在中国农业科学院棉花研究所试验田（河南安阳）取双交F1个体幼嫩叶片，在－70℃低温冰箱暂时保存，并尽快提取DNA。
在DNA纯化时，沉淀前分成两份，最后一份风干后加TE溶解，供后续SSR标记群体扩增使用；另一份用76%的乙醇洗至无色后加1.5ml76%乙醇，放－20℃保存，备用。
DNA的提取参照CTAB法[12]并加以改良。
提取方法如下：
a）将摘取的嫩叶叶片放入研钵中，研磨成粉末状，将粉末装入7mL的离心管中，约1/3，加入3mL提取缓冲液（表1.1），震荡混匀。
该操作过程要迅速，防止叶片被氧化。
b）将离心管对称放置于离心机，4℃，3000r/min，离心15min。
c）将离心管取出，倒掉上清液，加入3mL65℃预热的裂解缓冲液（表1.2），摇匀后放入65℃水浴锅中，水浴40min，每10min混匀一次。
d）待完全裂解后取出离心管，加入等体积的氯仿：
异戊醇（24：
1）抽提液，摇至乳浊状。
在离心机内离心18min，25℃。
e）吸取上清，转入新的7ml离心管，按步骤4重复抽提一次。
f）吸取上清，转入新的7ml离心管，加入0.6倍体积的冰冻异丙醇，缓慢摇匀至沉淀析出。
－20℃下放置30min以上。
g）钩出沉淀，转入灭菌7ml离心管，用76％的酒精洗至酒精无色。
换无水乙醇洗一遍，尽可能倒干净乙醇，风干45min（分子克隆实验指南第三版上建议风干15min，必要时可将重溶了DNA的离心管在45℃加热块上敞口2-3min以挥发尽残留的乙醇）,在DNA沉淀仍有些潮湿的时候，用TE溶解。
h）加等体积氯仿：
异戊醇（体积比为24 ：
1）抽提液，冷却后，摇匀（约50次）。
以2700g离心18min，25℃。
i）吸取上清，加入2倍体积的冰冻无水乙醇和1/10体积的乙酸钠（3M,pH5.2），缓慢摇匀至沉淀析出。
－20℃下放置30min以上。
DNA纯化后，用紫外－可见光分光光度计测定亲和双交F1单株的DNA样原液的浓度。
计算平均浓度，以此为依据稀释DNA工作液。
对PCR实验中显带过弱的个别DNA工作液，应当降低稀释倍数。
表1.1棉花DNA提取缓冲液配方
试剂
终浓度
每升用量
Glucose
0.35M
63.1g
1MTris母液
0.1M
100ml
0.5MEDTA母液
0.005M
10ml
PVP40
2%（w/v）
20g
DIECA
0.1%（w/v）
1g
VitC
0.1%（w/v）
1g
β-巯基乙醇
0.2%
2ml
表1.2棉花DNA裂解缓冲液配方
试剂
终浓度
每升用量
1MTris母液
0.1M
100ml
NaCl
1.4M
81.8g
0.5MEDTA母液
0.02M
40ml
CTAB
2％
20g
PVP40
2％
20g
DIECA
0.1％
1g
VitC
0.1％
1g
β-巯基乙醇
0.2％
2ml
1.3SSR分子标记技术
1.3.1SSR分子标记
本实验采用简易优化后的反应体系（表1.3）。
TaqDNA聚合酶采用楚和霞光生物技术发展中心的高温嗜热TaqDNA聚合酶，采用附带的含Mg2+的PCR缓冲液（20mMMgSO4，100mMKCl,80mM（NH4）2SO4，100mMTris-HCl，pH9.0,0.5%NP-40）。
dNTP主要采用的是Genview分装产品。
表1.3SSR标记10μ1反应体系
试剂
终浓度
用量
超纯水
10×PCRBuffer
-
1×
6.20μ1
1.00μ1
10mMdNTP
0.5mM
0.50μ1
正向引物（10μM）
0.3μM
0.50μ1
反向引物（10μM）
0.3μM
0.50μ1
TaqDNA聚合酶（5U/μ1）
0.05U/μ1
0.10μ1
模板DNA（30ng/μ1）
3.0ng/μl
1.20μ1
表1.4SSRPCR扩增程序
步骤
作用
温度
时间
Step1
预变性
95℃
45s
Step2
变性
94℃
30s
Step3
退火
55℃
45s
Step4
延伸
72℃
45s
Step5
循环
GOTOStep2
28次
Step6
变性
94℃
变性1min
Step7
退火
55℃
退火45s
Step8
延伸
72℃
延伸1min
Step9
保存
4℃
至取出
扩增反应使用的PCR仪主要是MJResearch,Inc的ProgramableThermalController和Biometra的T1thermocycler与TGradient。
反应程序依常规PCR原理设计，使用程序DZH55（表1.4）。
用于基因型鉴定的SSR引物来源于CMD网站（http:
//www.cottonmaker.org/）公布的序列。
1.3.2PCR扩增
PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（表1.5）电泳对扩增产物进行分离，使用小板胶，大小为180×120×1mm，电泳缓冲液为1×TBE，每孔DNA点样量为1.7µl，在180V电压条件下电泳50min左右。
表1.5聚丙烯酰胺凝胶（8%）配方
试剂
每板用量
聚丙烯酰胺胶母液
5.4ml
5×TBE
ddH2O
TEMED
10%过硫酸铵
总计
4ml
10.3ml
14.1µl
360µl
20ml
银染过程及溶液配方如下：
a）固定将取下的凝胶（通常两块）放入盛有400ml固定液（340mlH2O+40ml95%酒精＋20ml10％乙酸）的胶盒中，在摇床上轻摇，固定至少5-6min,回收固定液，用纯水洗一遍凝胶。
b）渗透倒入300ml渗透液（0.6gAgNO3＋300mlH2O），在摇床上渗透12min，倒去渗透液，用纯水洗两遍，约30s。
c）显色倒入400ml显色液（6gNaOH＋4mlCH2O＋4ml0.2%Na2S2O3＋400mlH2O），在摇床上轻摇至条带清晰地显出，倒去显色液，然后用纯水洗两遍。
d）终止可加入400ml终止液（3gNa2CO3＋400mlH2O），暂时保存。
注：
以上银染中所用的固定液、渗透液和显色液需要现配现用，不可久存。
最后在观片灯上记录带型，只记录清晰可辨的显色比较好的条带，而忽略显色很弱的条带，那些亲本中有而在F1没有相对应条带的和F1中新产生的亲本无相对应条带的也同样忽略不记。
采用01法记录带型，在对应位置有条带的记为1，没有条带的记为0。
1.4数据分析
本研究对实验所得数据采用EXCEL2010和SPSS17.0进行分析。
用EXCEL2010办公软件对棉花F1群体的产量性状（株高、果枝、单株铃数、铃重、衣分、籽）进行描述性统计分析，包括平均数、最大值、最小值和极差等；用“双样本异方差假设的t-测验”对单标记辅助选择效果及聚合效果进行显著性分析。
用SPSS17.0的“AnalyzeDescriptivestatisticsDescritives”功能在本实验所组配的双交F1单株进行产量性状的平均数、标准差等常规统计分析及正态性分布检验。
用SPSS17.0中“BivariateCorrelations”对双交F1的产量性状进行相关性分析。
第2章结果与分析
2.1SSR结果
本实验中，4个亲本材料9125765、9125770、9125772和9125776是海1和中棉所36通过杂交、回交、自交得到的渐渗系。
1234
运用在海1和中棉所36中有多态性的引物对4个亲本9125765、9125770、9125772和9125776进行扩增，结果显示，共有60多个标记在亲本中具有多态性，其中第20号染色体上5个标记具有多态性，第8号染色体上2个标记具有多态性，在261个双交F1群体的扩增中，部分结果如下：
1234
图2.1双交F1群体扩增片段部分结果（1、2、3、4为亲本）
2.2渐渗片段聚合分析
2.2.1描述性统计
由表2.1可见，在双交F1群体中，世代单株株高、果枝、铃数、籽棉、皮棉、铃重和衣分等的平均值分别为102.346、11.22989、13.7605、59.14812、15.45766、4.305495和27.47159，都介于亲本产量的最大值和最小值之间。
表2.1双交F1单株产量性状基本统计分析
性状
样本数
最小值
最大值
平均数
标准差
偏度
株高
261
54
127
102.364
11.60445
-0.58761
果枝
261
5
18
11.22989
2.04018
-0.33114
铃数
261
4
29.5
13.7605
5.553353
0.618609
籽棉
261
17.31
151.45
59.14812
25.59494
0.744132
皮棉
261
5.64
37.74
15.45766
5.761356
0.934425
铃重
261
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