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1、不同渐渗片段聚合对产量品质的影响分析ANYANG INSTITUTE OF TECHNOLOGY 本 科 毕 业 论 文 不同渐渗片段聚合对产量品质的影响分析Different Segments of Introgressive Aggregation Effect on Cotton Production Quality Analysis学院名称： 生物与食品工程学院 专业班级： 2009级生物技术 学生姓名： 王振平 学 号： 200906060012 指导教师姓名： 卢全伟 指导教师职称： 讲师 2013年5月毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重承诺：所呈交的毕业设

2、计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得安阳工学院及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日期： 使用授权说明本人完全了解安阳工学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它

3、复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。作者签名： 日 期： 目 录中文摘要、关键词 I英文摘要、关键词 II引 言 1第1章 材料与方法 31.1试验材料 31.1.1材料的选择 31.1.2材料的获取 31.2基因组DNA提取 31.3 SSR分子标记技术 51.3.1 SSR分子标记 51.3.2 PCR扩增 61.4 数据分析 7第2章 结果与分析 92.1 SSR结果 92.2渐渗片段聚合分析 92.2.1描述性统计 92.2.2相关性分析 102.2.3正态分布分析 112.3产量性状分子标记辅助选择效果分析 132.3.1单标记辅助选择效果检测

4、标记 132.3.2两个不同位点QTLs聚合效果检测 15第3章 讨论 163.1染色体片段代换系 163.1.1理想的染色体片段代换系 163.1.2染色体片段代换系的特点 163.2分子标记辅助选择 163.3 QTL与QTL间的互作效应 163.4影响分子标记辅助选择检测效果的因素 173.4.1背景材料及QTL互作的影响 173.4.2尚未检测的QTL的影响问题 173.4.3分组群体大小 173.5分子标记辅助选择前景展望 17结 论 19参考文献 20致 谢 22不同渐渗片段聚合对棉花产量品质的影响分析摘要：利用生产上推广的优良早熟陆地棉栽培品种中棉所36为受体亲本、海岛棉海1为供

5、体亲本，构建一套渐渗有海1染色体片段的代换系群体BC5F3，并从其中选取4个纤维品质优良、在不同环境遗传稳定、渐渗片段较少的亲本材料通过单交、双交配制双交组合，进一步研究不同渐渗片段聚合对棉花产量性状影响。结果显示，在单标记辅助选择中，选出了5对与产量显著相关的标记，其中4对位于第20号染色体上，1对位于第8号染色体上，均与部分产量性状显著相关。在双标记辅助选择中，分析了两组标记，一组标记均位于第20号染色体上，当两个标记都聚合时，比聚合任何一个效果都好，只聚合一个时，反而不如单标记效果好；另一组标记，分别位于20号和8号染色体上，分析表明，无论聚合2个标记还是只聚合1个效果都不如单标记好。关

6、键词：棉花 渐渗系 分子标记辅助选择 QTL定位 聚合 纤维产量 Different Segments of Introgressive Aggregation Effect on Cotton Production Quality AnalysisAbstract：This test using the production on the promotion of good early upland cotton cultivars of cotton 36 for receptor parent, sea island cotton 1 as the donor parent, has b

7、uilt a set of introgressive BC5F3 sea 1 chromosome segment substitution is group, and four from the selection of the fiber are of good quality, and genetic stability in different environment, segments of introgressive less parental materials by single cross and double/compound double cross combinati

8、on, further study on different segments of introgressive aggregation effect on cotton yield. , according to the results in the single marker assisted selection, choose the 5 were significantly associated with production of tag, including four in chromosome 20, on chromosome 1 in 8, are associated wi

9、th a significant portion of the yield characters. In double marker assisted selection, two sets of tags are analyzed, a set of tags are located on chromosome 20, when two tags are aggregation, than any one aggregation effect is good, just a, it is better than single marker effect is good; Another se

10、t of tags, located on chromosome 8 and 20 respectively analysis showed that the polymerization 2 tags or aggregated one effect is not as good as single tag.Key words：Cotton Department of introgressive Marker-assisted selection QTL mapping The fiber producution引 言棉花是世界上重要的天然纤维作物，我国是世界棉花的主产国家，在我国国民经济中

11、占有重要地位。通过多年的资源引进与育种研究，我国的棉花单产得到一定提高，品质也有所改善。但我国棉花遗产基础普遍比较狭窄，棉属种间遗传多样性高，陆地棉品种见得遗传多样性低，遗传基础狭窄，利用多种途径改善陆地棉的遗传多样性是棉花种质资源工作的重要内容。棉花的大多数性状,特别是那些与产量、品质等有关的性状一般是由多基因控制的数量性状（quantitative trait），从育种的角度讲，对数量性状的遗传操纵能力决定了育种的效率。由于数量性状受多基因控制，遗传基础复杂，易受环境影响，表现为连续变异，且表现型与基因型之间没有明确的对应关系，因此，对数量性状的遗传研究十分困难，导致数量性状的遗传研究远远

12、落后于质量性状，限制了数量性状在作物遗传改良中的应用。传统的改良方法在棉花品种1改良中效率低，周期长，且无法确定单个数量性状位点在染色体上的具体位置。随着分子生物学的快速发展，出现了DNA分子标记技术，为育种工作者提供了一种快速、准确的选择方法，利用分子标记遗传连锁图，棉花的许多QTLs已被定位在染色体的特定区段。与以往遗传标记相比， DNA分子标记具有很多无可比拟的优越性：不受环境的影响，在生物发育的不同阶段和不同组织的DNA都可用于标记分析；生物基因组变异丰富，分子标记数量多；表现中性，目标性状不受影响；大多分子标记呈共显性，可用于鉴定杂合与纯合基因型个体；检测方法简单、迅速，节省人力。目

13、前，DNA分子标记技术已广泛应用于作物遗传图谱构建、重要性状基因或QTL定位、品种指纹图谱和纯度鉴定、种质资源遗传多样性分析以及分子标记辅助选择2（Molecular marker assisted selection，MAS）育种等科学研究中。染色体片段代换系3（Chromosome Segment Substitution Lines，CSSLs），即渐渗系，是指通过高代回交并自交，借助分子标记辅助选择获得的一套具有受体亲本背景并渐渗有一个或几个小的供体亲本染色体片段的群体。导入系和由导入系发展而来的染色体单片段代换系4(Single chromosome segments substit

14、utionlines)由于基因组绝大部分区段与轮回亲本相同,仅含少数或单个供体亲本的染色体片段,因而导入系和轮回亲本的任何表型差异都是由导入片段引起的,最大限度排除了遗传背景与基因间的干扰,是对QTL进行精细定位与克隆的良好材料。CSSLs的特点是：遗传背景单一性，每个CSSL的基因组只渐渗有一到几7个供体亲本的染色体片段，大部分背景与轮回亲本相同，遗传背景简单，提高QTL定位的精确度；稳定性，CSSLs是永久性分离群体，可以进行多年、多点、多重复的实验，研究QTL的稳定性；可分割性，CSSLs的代换片段可通过回交或者重组的方法再分割成长度更短的片段。构建CSSLs的方法是通过杂交后高代回交，

15、并结合分子标记辅助选择进行培育。具体试验步骤是：选择所要研究的两个表型差异比较大的受体亲本和供体亲本杂交形成F1，F1与受体亲本进行多代回交并自交，在早代回交群体中，利用分子标记辅助选择，选留符合要求的个体，最终构建成一套染色体片段代换系。高密度的分子标记5遗传连锁图可将数量性状分解为单个孟德尔因子进行分析,从而确定QTL在染色体上的位置及各种遗传效应6。QTL定位常用分离群体，包括F2/ F2:3、BC1、DH、RILs等，这些分离群体的遗传背景复杂，对遗传效应的干扰比较严重，造成QTL定位准确性不高。利用杂交、高代回交7并结合分子标记辅助选择构建的染色体片段代换系，背景简单，基本与轮回亲本

16、相同，基因组只含有一个或几个小的供体亲本的染色体片段，可用于进行多年多点多环境的重复试验，利用此群体进行QTL检测8，可有效减少遗传背景干扰，提高QTL定位的准确度，是研究QTL的理想材料9。本研究正是基于上述这种状况，并在前人研究的基础上，就如何提高棉花产量而做出以下实验方案，以生产上大面积推广的早熟陆地棉中棉所36为轮回亲本和海岛棉海1为供体亲本构建染色体片段代换系，实现海岛棉优良特性基因向陆地棉的渐渗，获得具有稳定的纤维品质优良的CSSLs材料；并从这套代换系中选取4个纤维品质优良、在不同环境中遗传稳定、渐渗片段较少的材料作为亲本，通过单交、双交配制双交组合，进行下一步棉花聚合育种；筛选

17、染色体单片段代换系，进行精细定位基因，这对创制优异棉花新材料具有十分重要的意义。第1章 材料与方法1.1试验材料1.1.1 材料的选择试验材料的亲本为陆地棉品种中棉所36和海岛棉新品系海1，其中轮回亲本中棉所36是中国农业科学院棉花研究所培育的品种，具高产早熟特性，纤维品质一般；供体亲本海1具有优良纤维品质、高抗黄萎病，晚熟，产量较低，为显性无腺体材料10。组配陆海杂交组合，利用中棉所36为轮回亲本进行回交，通过分子标记辅助选择，构建染色体片段代换系，从中选取4个（9125765、9125770、 9125772和 9125776）纤维品质优良、在不同环境遗传稳定、渐渗片段较少的亲本材料，通过

18、单交、双交配制双交组合。1.1.2 材料的获取本研究所在课题组自2003年至2007年以中棉所36为轮回亲本，以海1为供体亲本构建了一套染色体片段代换系，经过两年自交，2009年在河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验地种植了BC5F3家系（染色体片段代换系）世代（约2660个单株），每隔20行种植中棉所36（对照）1行。2009年4月26号播种，5米行长，0.8米行距，苗期拔除有腺体植株，定苗株距为0.25-0.26米；提取单株总DNA，按单株收取自然铃。按家系挑选了658个BC5F3单株（每个家系挑选4-5株），于2010年在河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验地种植，获得了658个BC5F

19、3:4株行，每隔20行种植1行中棉所36为对照。2010年4月27号播种，地膜覆盖，5米行长，0.8米行距，定苗株距为0.25-0.26米，6月20号去膜；按株行收取30铃进行产量品质的初步评价，筛选出408个株系进行多环境综合评价11，2011年于中国农业科学院棉花研究所试验地（河南安阳）种植BC5F3:5株系，每隔20个材料种植中棉所36对照，采用两重复，单行区试验，行长5米。 2012年将选取的4个亲本材料种植于河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验地，每个亲本种2行，每行20株，5米行长；双杂交F1代种20行，每行20株。田间管理同大田。1.2 基因组DNA提取在中国农业科学院棉花研究所

20、试验田（河南安阳）取双交F1个体幼嫩叶片，在70低温冰箱暂时保存，并尽快提取DNA。在DNA纯化时，沉淀前分成两份，最后一份风干后加TE溶解，供后续SSR标记群体扩增使用；另一份用76%的乙醇洗至无色后加1.5 ml76%乙醇，放20保存，备用。DNA的提取参照CTAB法12并加以改良。提取方法如下：a) 将摘取的嫩叶叶片放入研钵中，研磨成粉末状，将粉末装入7 mL的离心管中，约1/3，加入3 mL提取缓冲液（表1.1），震荡混匀。该操作过程要迅速，防止叶片被氧化。b) 将离心管对称放置于离心机，4，3000 r/min，离心15 min。c) 将离心管取出，倒掉上清液，加入3 mL65预热的

21、裂解缓冲液（表1.2），摇匀后放入65水浴锅中，水浴40 min，每10 min混匀一次。d) 待完全裂解后取出离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提液，摇至乳浊状。在离心机内离心18 min，25 。e) 吸取上清，转入新的7 ml离心管，按步骤4重复抽提一次。f) 吸取上清，转入新的7 ml离心管，加入0.6倍体积的冰冻异丙醇，缓慢摇匀至沉淀析出。20下放置30 min以上。g) 钩出沉淀，转入灭菌7 ml离心管，用76的酒精洗至酒精无色。换无水乙醇洗一遍，尽可能倒干净乙醇，风干45 min（分子克隆实验指南第三版上建议风干15 min，必要时可将重溶了DNA的离心管在45加热块

22、上敞口2-3 min以挥发尽残留的乙醇）,在DNA沉淀仍有些潮湿的时候，用TE溶解。h) 加等体积氯仿：异戊醇（体积比为24：1）抽提液，冷却后，摇匀（约50次）。以2700 g离心18 min，25。i) 吸取上清，加入2倍体积的冰冻无水乙醇和1/10体积的乙酸钠（3 M, pH 5.2），缓慢摇匀至沉淀析出。20下放置30 min以上。DNA纯化后，用紫外可见光分光光度计测定亲和双交F1单株的DNA样原液的浓度。计算平均浓度，以此为依据稀释DNA工作液。对PCR实验中显带过弱的个别DNA工作液，应当降低稀释倍数。表1.1 棉花DNA提取缓冲液配方试剂终浓度每升用量Glucose0.35 M

23、63.1 g1M Tris母液0.1 M100 ml0.5M EDTA母液0.005 M10 mlPVP402%(w/v)20 gDIECA0.1%(w/v)1 gVit C0.1%(w/v)1 g-巯基乙醇0.2%2 ml表1.2 棉花DNA裂解缓冲液配方试剂终浓度每升用量1 M Tris母液0.1 M100 mlNaCl1.4 M81.8 g0.5 M EDTA母液0.02 M40 mlCTAB220 gPVP40220 gDIECA0.11 gVit C0.11 g-巯基乙醇0.22 ml1.3 SSR分子标记技术1.3.1 SSR分子标记本实验采用简易优化后的反应体系（表1.3）。Ta

24、q DNA聚合酶采用楚和霞光生物技术发展中心的高温嗜热Taq DNA聚合酶，采用附带的含Mg2+的PCR缓冲液（20 mM MgSO4，100 mM KCl, 80 mM(NH4)2SO4，100 mM Tris-HCl，pH 9.0, 0.5% NP-40）。dNTP主要采用的是Genview分装产品。表1.3 SSR标记10 1反应体系试剂终浓度用量超纯水10PCR Buffer-16.20 11.00 110 mM dNTP 0.5 mM0.50 1正向引物 (10 M)0.3 M0.50 1反向引物 (10 M)0.3 M0.50 1Taq DNA聚合酶 (5 U/1)0.05 U/1

25、0.10 1模板DNA (30 ng/1)3.0 ng/l1.20 1表1.4 SSR PCR 扩增程序步骤作用温度时间Step1预变性9545 sStep2变性9430 sStep3退火5545 sStep4延伸7245 sStep5循环GOTO Step228次Step6变性94变性1 minStep7退火55退火45 sStep8延伸72延伸1 minStep9保存4至取出扩增反应使用的PCR仪主要是MJ Research, Inc的Programable Thermal Controller和Biometra的T1 thermocycler与TGradient。反应程序依常规PCR原理

26、设计，使用程序DZH55（表1.4）。用于基因型鉴定的SSR引物来源于CMD网站（http:/www.cottonmaker.org/）公布的序列。1.3.2 PCR扩增 PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（表1.5）电泳对扩增产物进行分离，使用小板胶，大小为1801201 mm，电泳缓冲液为1TBE，每孔DNA点样量为1.7 l，在180 V电压条件下电泳50 min左右。表1.5 聚丙烯酰胺凝胶（8 %）配方试剂每板用量聚丙烯酰胺胶母液5.4 ml5TBEddH2OTEMED10%过硫酸铵总计4 ml10.3 ml14.1 l360 l20 ml银染过程及溶液配方如下：a) 固定 将取下

27、的凝胶(通常两块)放入盛有400 ml固定液（340 ml H2O+40 ml 95%酒精20 ml 10乙酸）的胶盒中，在摇床上轻摇，固定至少5-6 min,回收固定液，用纯水洗一遍凝胶。b) 渗透 倒入300 ml渗透液（0.6g AgNO3300ml H2O），在摇床上渗透12 min，倒去渗透液，用纯水洗两遍，约30 s。c) 显色 倒入400 ml显色液（6g NaOH4ml CH2O4ml 0. 2%Na2S2O3400 ml H2O），在摇床上轻摇至条带清晰地显出，倒去显色液，然后用纯水洗两遍。d) 终止 可加入400 ml终止液（3g Na2CO3400ml H2O），暂时保存

28、。注：以上银染中所用的固定液、渗透液和显色液需要现配现用，不可久存。最后在观片灯上记录带型，只记录清晰可辨的显色比较好的条带，而忽略显色很弱的条带，那些亲本中有而在F1没有相对应条带的和F1中新产生的亲本无相对应条带的也同样忽略不记。采用01法记录带型，在对应位置有条带的记为1，没有条带的记为0。1.4 数据分析本研究对实验所得数据采用EXCEL 2010和SPSS 17.0进行分析。用EXCEL 2010办公软件对棉花F1群体的产量性状（株高、果枝、单株铃数、铃重、衣分、籽)进行描述性统计分析，包括平均数、最大值、最小值和极差等；用“双样本异方差假设的t-测验”对单标记辅助选择效果及聚合效果

29、进行显著性分析。用SPSS 17.0的“AnalyzeDescriptive statisticsDescritives”功能在本实验所组配的双交F1单株进行产量性状的平均数、标准差等常规统计分析及正态性分布检验。用SPSS 17.0中“Bivariate Correlations”对双交F1的产量性状进行相关性分析。第2章 结果与分析2.1 SSR结果本实验中，4个亲本材料9125765、9125770、 9125772和 9125776是海1和中棉所36通过杂交、回交、自交得到的渐渗系。1 2 3 4 运用在海1和中棉所36中有多态性的引物对4个亲本9125765、9125770、 912

30、5772和 9125776进行扩增，结果显示，共有60多个标记在亲本中具有多态性，其中第20号染色体上5个标记具有多态性，第8号染色体上2个标记具有多态性， 在261个双交F1群体的扩增中，部分结果如下：1 2 3 4 图2.1 双交F1群体扩增片段部分结果（1、2、3、4为亲本）2.2 渐渗片段聚合分析2.2.1 描述性统计由表2.1可见，在双交F1群体中，世代单株株高、果枝、铃数、籽棉、皮棉、铃重和衣分等的平均值分别为102.346、11.22989、13.7605、59.14812、15.45766、4.305495和27.47159，都介于亲本产量的最大值和最小值之间。表2.1 双交F1单株产量性状基本统计分析性状样本数最小值最大值平均数标准差偏度株高26154127102.36411.60445-0.58761果枝26151811.229892.04018-0.33114铃数261429.513.76055.5533530.618609籽棉26117.31151.4559.1481225.594940.744132皮棉2615.6437.7415.457665.7613560.934425铃重261