包埋好的标本用切片机切石蜡切片.docx
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包埋好的标本用切片机切石蜡切片
包埋好的标本用切片机切石蜡切片（5微米），并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。
经60℃烘片2-8小时（都试过，没啥差别，但非实质性器官应适当延长时间）。
二甲苯Ⅰ脱蜡30分钟（若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60℃），二甲苯Ⅱ脱蜡10分钟。
梯度酒精复水：
100%酒精3分钟，100%酒精3分钟，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟,75%酒精3分钟，50%酒精3分钟，蒸馏水3分钟，蒸馏水3分钟，PBS5分钟。
进行抗原修复：
将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力三分钟至微微沸腾，再用50火力维持7分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。
用PBS3分钟，用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（无色的5�S或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液）在湿盒中37℃封闭30分钟（室温30分钟也可）。
用滤纸擦去封闭液，勿洗。
滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜（37℃1小时多也差不多），再用PBS3分钟×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。
滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，用PBS3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。
滴加DAPI避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳。
用PBS1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。
最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察。
收起
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2%TritonX-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗（用1%BSA稀释）30分钟，闭光!
!
!
11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95%甘油封片
注：
4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：
有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3.0.2%TritonX-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：
1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
细胞免疫荧光简单实验步骤如下:
漂洗血清蛋白H7.2-7.437度PBS2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟
3.PBS洗净:
3min*3
4.1%Triton:
25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:
2*5min
6.羊血清封闭：
37度，20分钟
7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净，3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
10.37度 PBS洗净，3*5min
凉干封片（封闭液PH8.5）
不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
三种细胞免疫荧光染色操作步骤|实验
2015-04-03互联网生物在线生物在线
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免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2%TritonX-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗（用1%BSA稀释）30分钟，闭光!
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11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95%甘油封片
注：
4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：
有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3.0.2%TritonX-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：
1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
细胞免疫荧光简单实验步骤如下:
漂洗血清蛋白H7.2-7.437度PBS2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟
3.PBS洗净:
3min*3
4.1%Triton:
25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:
2*5min
6.羊血清封闭：
37度，20分钟
7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净，3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
10.37度 PBS洗净，3*5min
凉干封片（封闭液PH8.5）
不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
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免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：
1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟
3、4%的甲醛室温固定20-30分钟
4、1×PBS洗3次，每次10分钟
5、0.2%TritonX-100透化2-5分钟
6、1×PBS洗3次，每次10分钟
7、5%BSA室温封闭30分钟
8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜
9、1×PBS洗3次，每次10分钟
10、加二抗（用1%BSA稀释）30分钟，闭光!
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11、1×PBS洗3次，每次10分钟
12、95%甘油封片
注：
4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释
细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：
1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：
有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3.0.2%TritonX-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5.一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议：
1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
细胞免疫荧光简单实验步骤如下:
漂洗血清蛋白H7.2-7.437度PBS2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟
3.PBS洗净:
3min*3
4.1%Triton:
25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:
2*5min
6.羊血清封闭：
37度，20分钟
7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度 1-2小时
8.4度 PBS洗净，3min*5次
9.二抗 37度小于一小时
10.37度 PBS洗净，3*5min
凉干封片（封闭液PH8.5）
不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
脑组织冰冻切片做免疫荧光的过程和注意（冰冻切片,免疫荧光,脑组织,大鼠脑组织）
2014-09-0603:
28:
50来源：
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[脑组织冰冻切片做免疫荧光的过程和注意（冰冻切片,免疫荧光,脑组织,大鼠脑组织）]我是用大鼠脑组织做冰冻切片,先用一抗,然后用标记荧光素（FITC）的二抗,最后封片,在荧光显微镜下观察.以前没作过,请大家提供全过程和注意事项,包括切片前的固定方法.非常感谢!
关键词:
[冰冻切片免疫荧光脑组织大鼠脑组织一抗二抗荧光显微镜]…我是用大鼠脑组织做冰冻切片,先用一抗,然后用标记荧光素（FITC）的二抗,最后封片,在荧光显微镜下观察.以前没作过,请大家提供全过程和注意事项,包括切片前的固定方法.
非常感谢!
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请大家赐教啊,非常感谢
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Ifyourantibodyworksonformalinfixedtissuesection,youcanperfuseyouanimalby10%formalinandmakefloatingfrozensectionorparaffinsection.
IfyourAbdoesnotworkonformalinfixedsection,makefrozensectionasnormal（inOTC）andfixitbyacetone.Pleasetakecarewhenyoumoveoutunfixedbrain.
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不知道我的回贴流流朋友能否看到。
方
大鼠脑切片一定要先灌流，因为不灌流回有一些瘀血在组织切片中残留，会影响你的结果分析的。
灌流的方法就是：
先麻醉大鼠，用生理盐水，从左心室灌入，剪破心耳或是右心房，用重力自然灌流。
看到眼睛和肢体发白即可
方法一：
1，用4%的多聚甲醛灌注固定。
这样固定效果和形态都很好。
取大脑，在至于4%的多聚甲醛中固定，可以4度过夜。
2，用10%，20%，30%的蔗糖溶液分级脱水。
这样可保证在进行冰冻切片的时候没有太多的冰晶。
3，oct包埋，切片。
4，切片自然干燥。
5，可重新入水，免疫组化。
方法二：
该方法更为简单
1，灌流后取大脑
2，将新鲜组织直接冻于-20度中。
3，切片
4，4%多聚甲醛固定20min
5，pbs洗3x15min
6，干燥，-20度保存
7，免疫组化
脑组织冰冻切片做免疫荧光的过程和注意（冰冻切片,免疫荧光,脑组织,大鼠脑组织）]延伸阅读：
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间接免疫荧光法操作流程
滴定平板技术™
（以5×5mm反应区为例）
为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术™:
滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。
系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。
因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。
并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。
准备：
检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。
如果不是，用湿纸巾擦干净，必要时可用一点家用洗涤剂，再用足量的水冲洗。
随后从试剂盒中取出载片，等平衡到室温时方可打开包装。
注意不要触及生物薄片。
必要时可用笔编号、标记。
稀释：
根据实验设计，用磷酸盐缓冲液（PBS-Tween20）稀释血清。
注意：
阳性和阴性对照不需稀释，使用前要混匀，每次实验均须做对照。
加样：
将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。
滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。
第一次温育：
将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。
确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。
室温温育30分钟。
清洗：
用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即（不要吹干）将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。
不需振荡。
加样：
滴加20ulFITC标记的抗人免疫球蛋白（结合物）至洁净加样板的反应区中，完全加完所有的二抗后，方可继续温育。
注意：
FITC标记的抗人免疫球蛋白使用前需混匀。
为节约时间，可在第一步温育的同时滴加荧光二抗至另一个加样板的反应区中。
第二次温育：
从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。
注意：
为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。
室温温育30分钟。
从现在开始，注意避免阳光直射载片。
清洗：
用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟（注意水流不要太急，不要直接对着基质冲），然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴伊文氏蓝作为衬染。
封片：
将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。
滴加甘油/PBS至盖玻片：
每一个反应区约10ul。
从磷酸盐缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。
将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。
然后继续下一张。
结果判断：
荧光显微镜下观察特异的荧光模型。
般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但组织结构的显示较差，易出现抗原弥散丢失的现象。
而石蜡组织切片由于组织固定较好，因而对组织结构显示较理想，但由于部分组织抗原易受化学试剂的破坏，因而在在组织较弱抗原的显示方面较不理想。
石蜡切片是不宜做免疫荧光的，因为固定剂用的是多聚甲醛，这样的话自发荧光非常高，根本无法染色。
所以还是应该选用冰冻切片，且用丙酮固定。
我做的就挺好的
脱蜡要彻底，抗原修复好的话，做出来应该没问题的。
1、石蜡切片浸二甲苯10min*2脱蜡，二甲苯/乙醇（1：
1）10min，这三步可脱腊彻底，然后就可以从无水乙醇——95%、80%、70%、50%乙醇常规步骤回水。
2、置0.01MPH6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波加热沸腾10min，（此步骤中间可间断并加水以补充蒸发的溶液），自然冷却。
3.5——10%牛血清封闭40min（呵呵，我偷懒，直接用培养细胞的完全培养基封闭），PBS洗，（若为细胞内抗原，可用PBS-TWEEN20，可以增加细胞通透性）
4.加稀释好的一抗，室温40~60min，PBS/PBST洗三次
5.加稀释好的FITC标记二抗，室温40min，（这一步时间很重要，不要超过60min，否则会造成很高的本底，一般按公司推荐的稀释度反应40min可获得很好的效果。
）
6、PBS洗去二抗，可以直接在水面上盖上盖玻片，也可以加防荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察。
还有一点，我曾经在同一张片子上先做免疫组化，酶显色后再加荧光标记的二抗反应，或者再加一次一抗后再用荧光二抗反应，同样能够看到特异荧光，两种染色方法结合，阳性结果一般都非常符合，可以提高阳性结果的检出效率。
我也在做免疫荧光，总没有阳性的结果，抗原修复这一步说明书上推荐用胰酶消化，应该用多大的浓度、消化的时间、还有如何配制？
还有就是微波加热时应如何掌握时间，我加热10分钟片子就掉光了。
期盼回复！
多谢！
抗体作用的时间不要太长，特别是二抗。
可以用0.01%的伊文氏兰（PBS溶液）稀释荧光抗体，伊文氏兰可以复染背景以降低非特异性荧光。
如果是背景自发荧光，则与抗体作用时间无关。
可以在加一抗之前用0.1%硼酸钠PBS溶液处理30min以降低自发荧光。
在拍照时适当降低检测灵敏度也可以降低本底，而且也可以在软件水平消除背景荧光，许多专业性的图象处理软件都有这个功能。
我做的是胎盘的双重免疫荧光，两个抗体分别是：
HBsAg和CD68。
HBsAg应该在胞浆，CD68应该在胞膜。
因为背景上红细胞太多了，整个片子上满视野都是红细胞的自发黄绿色的荧光，我把一抗的浓度调到了1：
254℃过夜都染不出来，我都快疯掉了。
请问有什么办法能降低背景的自发荧光吗？
laminin,不好意思，又麻烦你，我用新配的柠檬酸缓冲液微波修复抗原把CD68做出来了，可是HBsAg还是做不出来，我就试着配胰酶，我是从书店的实验书上看的（0.1%cacl2100ml+50mg的胰酶）这样浓度是0.05%呀，我看文献上一般是0.1%或0.125%的，我用0.05%的胰酶消化，结果没有结果，不起作用，我今天就先用柠檬酸修复，然后用胰酶消化37℃30分钟，结果片子又掉光了，真是郁闷，你看看我的胰酶有问题吗？
多谢！
！
！
浓度不是太大问题，但消化时间不能太长，太长也会造成抗原损失。
一般微波修复就够了，没有必要再用酶消化。
微波加热时间可以长，沸腾之后才计时。
如果抗原完全去交连的话，也会很容易造成抗原流失，特别是可溶性抗原。
要确定你的片子是不是一定有HBsAg存在，石蜡切片经乙醇、二甲苯等处理肯定会有抗原损失，如果抗原量太少也很容易被非特异性染色遮盖，切片太薄也会导致抗原容易流失，特别是胞浆中的抗原。
这时要尽量降低非特异性反应并适当提高灵敏度，如采链亲和素-生物素系统。
另外还有抗体的通透性因素，如果是胞浆或胞核抗原，最好用Triton100等洗涤剂处理一下，以增加膜通透性。
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