蛋白质组学实验方法_精品文档.doc
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2、蛋白质分离的双向电泳过程
2．1溶液配制
常用水化上样缓冲液
（Ⅰ）
尿素8M4.805g
CHAPS4%0.4g
DTT65Mm0.098g
Bio-Lyte0.2%（w/v）50μl（40％）
溴酚蓝0.001％10μl（1％溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml
（Ⅱ）
尿素7M4.2g
硫脲2M1.52g
CHAPS4%0.4g
DTT65Mm0.098g
Bio-Lyte0.2%（w/v）50μl（40％）
溴酚蓝0.001％10μl（1％溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml
（Ⅲ）
尿素5M3.0g
硫脲2M1.52g
SB3-102%0.2g
CHAPS4%0.4g
DTT65Mm0.098g
Bio-Lyte0.2%（w/v）50μl（40％）
溴酚蓝0.001％10μl（1％溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml
分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液
尿素6M36g
SDS2%2g
Tris-HCl0.05MpH8.83.3ml（1.5MpH8.8Tris-HCl）
甘油20％20ml
MilliQ水定容至100ml
分装成10管，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液Ⅰ
胶条平衡缓冲液母液10ml
DTT0.2g
充分混匀，用时现配。
胶条平衡缓冲液Ⅱ
胶条平衡缓冲液母液10ml
碘乙酰胺0.25g
充分混匀，用时现配。
低熔点琼脂糖封胶液
低熔点琼脂糖0.5％0.5g
Tris25mM0.303g
甘氨酸192mM1.44g
SDS0.1%1ml（10%SDS）
溴酚蓝0.001％100μl（1%溴酚蓝）
MilliQ水定容至100ml
加热溶解至澄清，室温保存。
30％聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺150g
甲叉双丙稀酰胺4g
MilliQ水500ml
滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/LTris碱pH8.8
Tris碱90.75g
MilliQ水400ml
用1mol/LHCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml,4℃冰箱保存。
10%SDS
SDS10g
MilliQ水100ml
10%过硫酸铵
过硫酸铵0.1g
MilliQ水1ml
现用现配。
10×电泳缓冲液
（1×＝25mMTris,192mMglycine,0.1%SDS,pH8.3）
Tris碱30g
甘氨酸144g
SDS10g
MilliQ水1L
混匀后，室温保存。
2．2操作步骤
2.2.1第一向等电聚焦
1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；在enpendoff管中，2.0mg蛋白干粉加入200μl水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。
具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，
ReadyStripTMIPG胶条长度
上样体积
分析型的上样量
（银染）
制备型的上样量
（考马斯亮兰染色）
7cm
125-250μl
10-100ug
200-500ug
17cm
300-600μl
100-300ug
1-3mg
2.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。
3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。
在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。
4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。
确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。
5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
6.对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
7cm胶条
水化12h（17-20℃）主动水化
S1250V慢速2h除盐
S2500V慢速1h除盐
S31000V快速1h除盐
S44000V线性3h升压
S54000V快速25000伏h聚焦
S6500V快速任意时间保持
17cm胶条
水化12h（17-20℃）主动水化
S1250V慢速2h除盐
S2500V慢速1h除盐
S31000V快速1h除盐
S48000V线性5h升压
S58000V快速60,000伏h聚焦
S6500V快速任意时间保持
l选择所放置的胶条数。
l设置每根胶条的极限电流。
l设置等电聚焦时的温度。
7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDS－PAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存1-2天。
2.2.2第二向SDS－PAGE电泳
1.配制12％的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。
待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。
2.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。
3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。
这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。
4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液Ⅰ。
将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。
5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液Ⅰ，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。
再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。
6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。
将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板再下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。
7.第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。
用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。
8.将放有胶条的SDS－PAGE凝胶转移到灌胶架上，短板一面对着自己，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。
注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。
10.放置5min，低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。
11.电泳起始时用低电流（7cm胶条：
5-10mA/gel；17cm胶条：
10mA/gel）或低电压（7cm胶条：
50-75V/gel；17cm胶条75-100V/gel），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流（7cm胶条：
10-15mA/gel；17cm胶条：
20-30mA/gel）或电压（7cm胶条：
150-200V/gel；17cm胶条：
300-400V/gel），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
12.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。
然后进行染色。
2．3染色方法
2.3.1考马斯亮蓝G-250染色
固定液：
45％（V/V）甲醇，1％（V/V）乙酸
G-250染色液：
17％（W/V）硫酸铵，34％（
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