心型脂肪酸结合蛋白h-FABPELISA试剂盒说明书_精品文档.doc

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心型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）酶联免疫分析试剂盒

预期应用

ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中心型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）含量。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗h-FABP抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗h-FABP抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的h-FABP呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1.酶联板：

一块（96孔）

2.标准品（冻干品）：

2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为150ng/ml，请先稀释至30ng/ml，再做系列倍比稀释（注：

不要直接在板中进行倍比稀释）后，分别稀释成30ng/ml，15ng/ml，7.5ng/ml，3.75ng/ml，1.88ng/ml，0.94ng/ml，0.47ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15分钟内配制。

如配制15ng/ml标准品：

取0.5ml（不要少于0.5ml）30ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3.样品稀释液：

1×20ml。

4.检测稀释液A：

1×10ml。

5.检测稀释液B：

1×10ml。

6.检测溶液A：

1×120μl（1:

100）临用前以检测稀释液A1:

100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7.检测溶液B：

1×120μl/瓶（1:

100）临用前以检测稀释液B1:

100稀释。

稀释方法同检测溶液A。

8.底物溶液：

1×10ml/瓶。

9.浓洗涤液：

1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.终止液：

1×10ml/瓶（2NH2SO4）。

11.覆膜：

5张

12.使用说明书：

1份

自备物品

1.酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）

2.微量加液器及吸头，EP管

3.蒸馏水或去离子水，全新滤纸

标本的采集及保存

1.血清：

全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：

可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.其它生物标本：

请1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：

以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。

实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：

分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。

空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。

每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。

终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

在加终止液后立即进行检测。

注：

1.试剂准备：

所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。

实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

2.加样：

加样或加试剂时，请注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。

一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。

3.孵育：

为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。

4.洗涤：

洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。

5.试剂配制：

DetectionA及DetectionB在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。

标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。

请精确配置标准品及工作液，尽量不要微量配置（如吸取检测溶液A时，一次不要小于10μl），以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

6.反应时间的控制：

加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7.底物：

底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

洗板方法

1.手工洗板方法：

吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。

2.自动洗板：

如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

本试剂盒可同时检测重组或天然的人h-FABP，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

以标准物的浓度为纵坐标（对数坐标），OD值为横坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线。

推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curveexpert1.3，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

检测范围：

0.312ng/ml-20ng/ml

灵敏度：

0.078ng/ml