福建农林大学分子生物学教案.docx

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福建农林大学分子生物学教案

教案

2005~2006学年第一学期

学院、系室　　　生命科学学院　生物技术系

课程名称　　　生物化学与分子生物学实验

专业、年级、班级　　2002级生物科学、生物技术

2003级生物技术（专升本）

主讲教师　　　甘纯玑、李今煜、谢苗、沙莉

实验　酵母ＲＮＡ的提取与分离

实验　大蒜细胞ＳＯＤ的提取与分离

实验SDS-PAGEＥ电泳

实验凝胶排阻层析

实验　多糖的水解及水解物的薄层层析测定

实验菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定

实验质粒DNA的提取及酶切

实验琼脂糖凝胶电泳检测DNA

实验PCR基因扩增

实验探针制备

实验Southern杂交

福建农林大学

教案编写说明

教案又称课时授课计划,是任课教师的教学实施方案。

任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标，以教学大纲为依据，在熟悉教材、了解学生的基础上，结合教学实践经验，提前编写设计好每门课程每个章、节或主题的全部教学活动。

教案可以按每堂课（指同一主题连续1~4节课）设计编写。

教案编写说明如下：

1、编号：

按施教的顺序标明序号。

2、教学课型表示所授课程的类型，请在理论课、实验课、习题课、实践课及其它栏内选择打“√”。

3、题目：

标明章、节或主题。

4、教学内容：

是授课的核心。

将授课的内容按逻辑层次，有序设计编排，必要时标以“*”、“#”“？

”符号分别表示重点、难点或疑点。

5、教学方式、手段既教学方法，如讲授、讨论、示教、指导等。

教学媒介指教科书、板书、多媒体、模型、标本、挂图、音像等教学工具。

6、讨论、思考题和作业：

提出若干问题以供讨论，或作为课后复习时思考，亦可要求学生作为作业来完成，以供考核之用。

7、参考书目：

列出参考书籍、有关资料。

8、日期的填写系指本堂课授课的时间。

福建农林大学教案

编号：

课时安排：

8学时

教学课型：

理论课√实验课□习题课□实践课□其它□

题目（教学章、节或主题）：

理论讲授、学生预习实验、实验预习报告面批

教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：

掌握实验准备的基本步骤

熟悉实验操作步骤

掌握实验中需要溶液的配制

熟悉实验内容

教学内容（注明：

*重点#难点？

疑点）：

（*）实验室规则——→实验室安全及防护知识——→（*）实验预习、实验记录与实验报告——→实验室基本操作——→（#）缓冲溶液与pH测定——→生化实验室的基本设施与装备

教学方式、手段、媒介：

讲授

板书设计：

1.1实验室规则

1.2实验预习、实验记录与实验报告格式

1.3实验室安全及防护知识

1.4缓冲溶液与pH测定

1.5实验室基本操作

1.6生物化学与分子生物学实验室的基本设施介绍

讨论、思考题、作业：

预习下周安排的实验

参考书目：

杨安钢，毛积芳，药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年版

周先碗，胡晓倩编，生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社，2003年版

苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年

何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年

张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年

卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年

教师姓名：

甘纯玑李今煜谢苗沙莉职称：

教授讲师讲师助教2005年11月05日

福建农林大学教案

编号：

课时安排：

8学时

教学课型：

理论课□实验课√习题课□实践课□其它□

题目（教学章、节或主题）：

实验酵母ＲＮＡ的提取与分离

教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：

掌握冷冻离心机的使用

掌握缓冲液的配制

熟悉RNA的特性反应及苯酚－乙醇提取法

做好实验记录

教学内容（注明：

*重点#难点？

疑点）：

原理

　　酵母细胞置于含有ＳＤＳ的缓冲液中，加等体积的苯酚水溶液，通过激烈振荡一段时间，将ＲＮＡ和蛋白质分开，然后离心分层，ＲＮＡ溶于上层水溶液中，ＤＮＡ和蛋白质在酚层，ＲＮＡ可用乙醇沉淀析出。

步骤

1、取５０ｇ新鲜湿酶母或8g干酵母，加入50ｍｌＳＤＳ一Ｔｒｉｓ缓冲液，再加入75ｍ１９０％苯酚水溶液，在室温下激烈振荡１ｈ，然后冷却至０～４℃，以下操作均在０～４℃进行。

　　2、上述提取液以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，分离出上层水相，加入１／１０体积的乙酸钾溶液，再加入２倍体积的９５％乙醇。

在一１６℃左右放置使ＲＮＡ沉淀析出。

此沉淀可在冰箱中（０－４℃）长期保存。

亦可将沉淀以４０００ｒ／ｍｉｎ离心10ｍｉｎ，取沉淀用少许３５％乙醇、９５％醇和无水乙醇各离心洗涤一次，然后将沉淀溶于少量１ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液中，４℃保存备用（或真空干燥）。

　　3、ＲＮＡ含量测定

教学方式、手段、媒介：

实验讲授、操作示范、指导

板书设计：

讨论、思考题、作业：

完成实验报告

参考书目：

杨安钢，毛积芳，药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年版

周先碗，胡晓倩编，生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社，2003年版

苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年

何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年

张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年

卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年

教师姓名：

甘纯玑李今煜谢苗沙莉职称：

教授讲师讲师助教2005年月日

福建农林大学教案

编号：

课时安排：

8学时

教学课型：

理论课□实验课√习题课□实践课□其它□

题目（教学章、节或主题）：

实验　大蒜细胞ＳＯＤ的提取与分离

教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：

掌握冷冻离心机的使用

掌握缓冲液的配制

掌握研磨等基本操作

熟悉SOD酶的一种提取法

做好实验记录

教学内容（注明：

*重点#难点？

疑点）：

原理：

超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子（Ｏ２－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：

２０２－＋Ｈ２＝Ｏ２＋Ｈ２０２。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的ＳＯＤ，通过组织或细胞破碎后，可用ｐＨ７.８磷酸缓冲液提取。

由于ＳＯＤ不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

步骤：

1、组织或细胞破碎

　　称取５ｇ左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。

2、ＳＯＤ的提取

　将上述破碎的组织或细胞，加入２～３倍体积的0.05mol／Ｌ，ｐＨ7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使ＳＯＤ充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000ｒ／min下，离心15min，弃沉淀，得提取液。

3、除杂蛋白

提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。

4、ＳＯＤ的沉淀分离

将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r／min离心15min，得ＳＯＤ沉淀。

将ＳＯＤ沉淀溶于0.05mol／Ｌ，pＨ7.8的磷酸缓冲液中，于55～60℃热处理15min，离心弃沉淀，得到ＳＯＤ酶液。

将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的ＳＯＤ活力。

5、ＳＯＤ活力测定

取３根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。

试剂　　空白管　　对照管　　样品管

碳酸缓冲液　５．０　　　　　５．０　　　　　５．０

ＥＤＴＡ溶液　　０．５　　　　　　０．５　　　　　　０．５

　蒸　馏　水　　　　　０．５　　　　　　０．５　　　　　　　－

　样　品　液　　　　　　－　　　　　　　－　　　　　　　０．５

混合均匀

肾上腺素液－　　　．５　　　　　　０．５

　　在加入肾上腺素前，充分摇匀并在３０℃水浴中预热５ｍｉｎ至恒温。

加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应２ｍｉｎ，然后立即测定各管在４８０ｎｍ处的光密度。

对照管与样品管的光密度值分别为Ａ和Ｂ。

　　在上述条件下，ＳＯＤ抑制肾上腺素自氧化的５０％所需的酶量定义为一个酶活力单位。

即：

酶活力（单位）＝　２·（A－B）·N/A

式中　N——样品稀释倍数;

２——抑制肾上腺素自氧化５０％的换算系数（100％/50％）。

　　若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算

酶活力单位/ml=[2·（A－B）·N/A][V/V1]=26·（A－B）·N/A

式中　V——反应液体积（6.５ｍｌ）;

V1——样品液体积（0.５ｍｌ）。

　　最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化过程收率。

教学方式、手段、媒介：

实验讲授、操作示范、指导

板书设计：

讨论、思考题、作业：

完成实验报告

参考书目：

杨安钢，毛积芳，药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年版

周先碗，胡晓倩编，生物化学仪器分析与实验技术，化学工业出版社，2003年版

苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年

何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年

张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997年

卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年

教师姓名：

甘纯玑李今煜谢苗沙莉职称：

教授讲师讲师助教2005年月日

福建农林大学教案

编号：

课时安排：

8学时

教学课型：

理论课□实验课√习题课□实践课□其它□

题目（教学章、节或主题）：

实验SDS-PAGEＥ电泳

教学目的要求（分掌握、熟悉、了解三个层次）：

掌握SDS-PAGE的操作

掌握电泳测定蛋白质分子量的方法

掌握凝胶电泳中各种试剂的作用

教学内容（注明：

*重点#难点？

疑点）：

原理：

SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。

SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。

这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。

由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。

操作过程：

1、准备步骤

1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。

2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。

3）灭菌枪头、eppendorf管。

2、制备凝胶

1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。

2）配制10%的分离胶（20ml）：

依次将8ml蒸馏水，6.7ml30%丙烯酰胺贮存液，5ml1.5mol/LTris（pH8.8）溶液，0.2ml10%SDS溶液，0.2ml10%过硫酸铵，0.008mlTEMED混合，立即灌胶。

3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。

小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。

4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中，配制5%的积层胶