分子生物学实验步骤总结超全_精品文档.doc

分子生物学实验步骤总结超全_精品文档.doc

《分子生物学实验步骤总结超全_精品文档.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验步骤总结超全_精品文档.doc（16页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

一目的基因的获得

细菌基因组DNA的提取

（一）仪器

1）台式高速离心机

2）恒温水浴箱

3）枪式移液器

4）灭菌的EP管和Tip头

（二）试剂

1）溶液1:

25%蔗糖

50mmol/LTris-Hcl，pH8.0

50mmol/LEDTA，pH8.0

500ug/ml溶菌酶（现用现配）

100ug/mlRNase

2）溶液Ⅱ：

100mmol/LTris-Hcl，pH8.0

1%SDS

400ug/ml蛋白酶K

3）酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1）

4）氯仿：

异戊醇（24：

1）

5）3mol/LNaAc（pH5.2）

6）异丙醇或无水乙醇

7）70%乙醇

8）TE缓冲液：

10mmol/LTris-Hcl，pH8.0

1mmol/LEDTA，pH8.0

（三）实验步骤

1）5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。

2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。

3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。

4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。

5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：

1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。

6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。

7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。

8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。

9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

植物DNA的SDS提取法：

（一）试验试剂：

1）研磨缓冲液：

称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2）10SSC溶液：

称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3）1SSC溶液：

用10SSC溶液稀释10倍。

4）0.1SSC溶液：

用1SSC溶液稀释10倍。

5）Rnase溶液：

用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6）氯仿－异戊醇：

按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7）5mol/L高氯酸钠溶液：

称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8）SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：

将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9）1mol／LHCl。

10）0.2mol/LNaOH。

11）二苯胺乙醛试剂：

1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：

H2O＝1：

50（V／V）］。

12）1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13）0.05mol/LNaOH。

14）DNA标准液：

取标准DNA25mg溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

（二）实验步骤：

1）称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2）将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。

以4000rpm离心5min。

3）离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4）将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：

高氯酸钠溶液＝4：

1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5）再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6）用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。

此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7）然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。

8）重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9）加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10）加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11）再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

二、PCR扩增目的基因

（一）器材

1）微量移液器

2）灭菌的Tip头、PCR管

3）PCR扩增仪

4）目的DNA（DNA模板）

5）dNTP混合物

6）引物对

7）Tap酶

8）PCR扩增试剂盒

（二）试剂

1）10×PCR缓冲液（含Tris-HCl100mmol/L;MgCl215mmol/L、KCl500mmol/L,pH8.3，0.1%明胶）

2）脱氧核苷三磷酸dNTPs：

配成10mM——dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。

）

3）氯仿-异戊醇：

配成24：

1的比例，室温避光保存。

4）酚：

氯仿：

异戊醇=25：

24：

1

5）3MNaAc、ddH2O

6）无水乙醇：

70%乙醇

7）TE缓冲液

（三）实验步骤

1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：

（混匀）

ddH2O:

补至终体积（25μl）

10×PCR缓冲液1/10总体积

2.0mMdNTPs1μl

2U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl

引物混合液（10pmol/μl/引物）1μl

DNA模板0.6μl

混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。

2）在设定好的PCR仪上反应

95°C，5min；95°C，1min；56°C，1min；72°C，2min。

反应30轮。

3）反应结束后，将反应管在72°C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至4°C。

取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳（实验三），确认是否有目的的PCR产物。

如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。

纯化继续4）—6）。

4）转至1.5ml离心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。

5）吸取上层液，转至另一已加5μl3MNaAc的1.5ml的离心管，加150μl无水乙醇，-20°C过夜。

6）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。

弃上清，烤箱中干（60°C），溶于20μlTE。

（四）技术要点

1）PCR各组份的配制与加样量要特别注意。

（1）引物浓度：

10pmol足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。

（2）引物的配制：

厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1OD约含33μg。

开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2μg/μl，再取部分稀释至10pmol/μl。

引物浓度计算公式：

1pmol=（3.3×10-4μg）×n，n是引物的碱基数

（3）Mg2+：

使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。

（4）模板DNA：

浓度不可过高，质粒DNA20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。

（5）TaqDNA聚合酶：

一般用量5U/100μl。

酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3’端加A。

2）扩增轮数与退火温度

扩增轮数：

一般30轮以内就可使模板扩增106倍，超过30轮，错配率升高。

退火温度计算公式：

Tm值=（GC×4+AT×2）–4

三、琼脂糖凝胶电泳的检测

（一）仪器

1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪）

2）凝胶成像仪

（二）试剂及材料

目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂

盒

1）TAE电泳缓冲液

浓储存液50×：

242gTris；57.1ml冰乙酸；100ml0.5mol/LEDTA（PH8.0）

定容至一升。

使用液1×：

4.84gTris；1.15ml冰乙酸；2ml0.5mol/LEDTA（PH8.0）

定容至一升。

2）样本液

10×缓冲液:

60%蔗糖；0.4%溴酚蓝

（三）实验步骤

1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。

2）0.8%琼脂凝胶板的配制：

取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°C-65°C，加入EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。

（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。

3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。

4）DNA样品按照10：

1的比例加入样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。

同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。

5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。

6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。

（四）技术要点

1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。

不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。

表1不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%）

分离DNA的有效范围（kb）

0.3

60～5

0.6

20～1

0.8

10～0.