二步法免疫组化步骤_精品文档.doc
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Sp二步法步骤啊,具体如下:
一、1烤片,65℃,2小时;
二、二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水:
二甲苯I20min--二甲苯II20min—无水乙醇I15min–无水乙醇II15min--95%乙醇10min--80%乙醇10min--70%乙醇10min–双蒸水10min
三、阻断灭活内源性过氧化物酶:
3%H2O237℃孵育10min,PBS冲洗3X5min;
四、抗原修复:
置0.01M枸橼酸缓冲液(PH6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min以上,至室温,PBS冲洗3X5min。
五、正常羊血清工作液封闭,37℃10min,倾去勿洗.
六、滴加适当比例稀释的一抗4℃冰箱孵育过夜或37℃孵育2—3小时,PBS冲洗3X5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);
七、滴加生物素标记的二抗,37℃孵育15min,PBS冲洗3X5min;
八、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育15min,PBS冲洗3X5min;
九、DAB显色:
1ml双蒸水先加一滴A,混合均匀,再加B和C,再次混匀,三夜混合后,室温反应2—10min,显微镜下观察,有棕黄色沉淀物,即自来水冲洗,终止反应。
十、苏木素复染3—5min,盐酸酒精分化1—2s,常规脱水,透明,干燥,封片。