CTAB法提取DNA原理及步骤制胶电泳_精品文档.doc

CTAB法提取DNA原理及步骤制胶电泳_精品文档.doc

《CTAB法提取DNA原理及步骤制胶电泳_精品文档.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CTAB法提取DNA原理及步骤制胶电泳_精品文档.doc（2页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

CTAB法提取DNA的原理及步骤：

冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。

通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。

低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。

通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。

随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB。

1.研磨

2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复）

预处理液：

Tris-hcl（PH8.0）提供缓冲环境，防止核酸被破坏。

EDTA（螯合二价阳离子）0.5M抑制DNase活性。

Nacl5M提供高盐环境，使DNA充分溶解。

β-巯基乙醇 抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成络合物，也可与糖结合。

3.加800ul2×CTBA（预热），10ulβ-巯基乙醇，65℃水浴1-2h。

15min震荡

4.冷至室温，离心1000r,10min,取上清750ul，加800ul氯仿-异戊醇（24:

1），抽提10min，1000r，15min,重复3次。

氯仿：

加速有机相与水相分层，去除核酸溶液中残余酚，抽提蛋白质等杂质。

5.取上清，加2倍体积的无水乙醇，-20℃,1h,沉淀DNA.

无水乙醇：

DNA不溶于酒精，CTAB和一些蛋白质可以，低温乙醇可抑制DNase活性，降低分子运动，易于DNA沉淀。

6.4℃，1000r,10min,倒乙醇，收集DNA.

7.70％乙醇洗涤2遍，风干（不可太干），溶于40-60uldd水。

DNA在凝胶中涌动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此能以同样的速率向正极移动。

在一定电场强度下，DNA分子的歉意速率取决于分子筛效应，即DNA本身的大小。

制胶步骤：

1.5％琼脂糖

1.配胶：

0.6g琼脂糖a

40ml1×TBEb

4ulEB剧毒

a、b混合在微波炉中加热，熔化，冷却至60℃以下，后加EB（慢）

加热沸出气泡，将其剥离，加EB（剧毒，小心使用，致癌）后慢摇匀。

2.倒在制胶槽中，插上梳子，待胶凝固后，拔下梳子。

3.将1×TBE（按配方配得5×TBE，再加蒸馏水稀释至1×TBE，即取一份5×TBE，加4份水）倒入电泳槽中，没过凝胶。

4.将制好的胶放入电泳槽中，点样（2ul溴酚蓝＋10ulDNA）,可以点在封口膜上，混匀，上样。

5.插电极，红黑线自搭。

开电源（100v,80mA）,溴酚蓝跑到整胶的三分之二时，关闭电泳仪电源，紫外灯下观察。