1、CTAB法提取DNA的原理及步骤: 冷冻的植物组织,在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA,都要加液氮使材料变脆,易于研磨。低温降低了DNase的活性,利用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜,使核蛋白等解聚,使DNA游离出来。 CTAB作为一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,与核酸形成复合物,可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中,再加乙醇使核酸沉淀,而CTAB溶于乙醇,从而去除CTAB 。 1. 研磨2. 加1000ul预处理液,10-15min,4000r,10min,弃上清(重复)预处理液:Tris-hcl (PH
2、8.0) 提供缓冲环境,防止核酸被破坏。 EDTA (螯合二价阳离子)0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境,使DNA充分溶解。 -巯基乙醇 抗氧化剂,去除酚,糖,能与酚形成 络合物,也可与糖结合。 3. 加800ul2CTBA(预热),10ul -巯基乙醇 ,65 水浴1-2h。 15min 震荡4. 冷至室温,离心1000r ,10min ,取上清750ul,加800ul氯仿-异戊醇(24:1),抽提10min,1000r,15min,重复3次。 氯仿:加速有机相与水相分层,去除核酸溶液中残余酚,抽提蛋白质等杂质。5. 取上清,加2倍体积的无水乙醇,-20,1h,沉淀
3、DNA. 无水乙醇:DNA不溶于酒精,CTAB和一些蛋白质可以,低温乙醇可抑制DNase活性,降低分子运动,易于DNA沉淀。6. 4,1000r,10min,倒乙醇,收集DNA.7. 70乙醇洗涤2遍,风干(不可太干),溶于40-60ul dd水。DNA在凝胶中涌动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷,因此能以同样的速率向正极移动。在一定电场强度下,DNA分子的歉意速率取决于分子筛效应,即DNA本身的大小。制胶步骤:1.5琼脂糖1.配胶:0.6g琼脂糖 a40ml 1TBE b4ulEB 剧毒a、b混合在微波炉中加热,熔化,冷却至60以下,后加EB(慢)加热沸出气泡,将其剥离,加EB(剧毒,小心使用,致癌)后慢摇匀。2.倒在制胶槽中,插上梳子,待胶凝固后,拔下梳子。3.将1TBE(按配方配得5TBE,再加蒸馏水稀释至1TBE,即取一份5TBE,加4份水)倒入电泳槽中,没过凝胶。4. 将制好的胶放入电泳槽中,点样(2ul溴酚蓝10ulDNA),可以点在封口膜上,混匀,上样。5. 插电极,红黑线自搭。开电源(100v,80mA),溴酚蓝跑到整胶的三分之二时,关闭电泳仪电源,紫外灯下观察。