真核生物基因定位基本方法和遗传图制作.docx

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真核生物基因定位基本方法和遗传图制作

真核生物基因定位的基本方法和遗传图的制作

图距（mapdistance）即指两个基因在染色体图上距离的数量单位，它是以重组值1%去掉%号表示基因在染色体上的一个距离单位，即某基因间的距离为一个图距单位（mapunit,mu）。

后人为了纪念现代遗传学的奠基人摩尔根，将图距单位称为"厘摩"（centimorgan,cM）。

假设两基因a-b间的重组率为17%，即这两个基因相距17个图距单位（17cM）。

　　基因定位（genemapping）是指将基因定位于某一特定的染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺序与距离。

基因定位的目的是通过将基因定位到染色体的基因座上后，以帮助我们理解和开发生物性状的遗传性质，特别是通过遗传连锁将一种性状的遗传与另一种性状或标记相联系，或者通过将表型差异与染色体结构的改变联系起来。

这在商业上可用于改良动植物的性状、定位和克隆人类的疾病基因等。

1．两点测交（two-pointtestcross）：

两点测交是指每次只测定两个基因间的遗传距离，这是基因定位的最基本方法。

（我仅重点介绍三点测交）

2．三点测交（three-pointtestcross）：

三点测交就是通过一次杂交和一次测交，同时确定三对等位基因（即三个基因位点）的排列顺序和它们之间的遗传距离，是基因定位的常用方法。

用三点测交能测出双交换，因此更能准确地反映出连锁基因间的相对距离。

同样，在做三点测交时需要用这三个基因的杂合子（abc/+++，或ab+/++c，或a++/+bc等）同这三个基因的隐性纯合子（abc/abc）测交。

下面还是以玉米的上述三个基因为例来说明，假如用于三点测交的两个亲本为：

+++/+++和cshwx/cshwx，则F1代的基因型为：

+++/cshwx，然后F1与三隐性纯合体cshwx/cshwx测交，获得如下的结果。

从上表可以看出，8种表型的实得籽粒数各不相等，且相差悬殊，说明它们是连锁的。

下面我们先不考虑wx，只考虑C-Sh间的情况，这样就可以计算出C-Sh间的重组值：

C-Sh=（98+107+39+19）/6033=4.36%。

按照同样的方法可算出Sh-Wx和C-Wx间的交换值分别为：

Sh-Wx=（672+662+39+19）/6033=23.07%和C-Wx=（98+107+672+662）/6033=25.51%。

　　根据这三个数据我们可以将这三个基因作如下的排列：

　　很明显，25.51不等于14.36+23.07。

刚才我们讲过，在两个基因之间如果发生双交换，从表型上是检测不出来的，也就是说双交换的结果等于不交换，现在我们再回到上表，其中（39+19）个个体分别在计算C-Sh和Sh-Wx之间各用了一次，说明有（39+19）的个体是发生了双交换，但是我们在计算C-Wx间的图距时，没有将这个双交换值算进去，显然C-Wx间的图距被缩小了，因此我们必须对这一结果进行校正。

我们先算双交换值：

（39+19）/6033=0.96%。

由于一次双交换实际上包含了二次单交换，所以在计算C-Wx间图距时，应加上2倍双交换值，即C-Wx=25.51+2×0.96=27.43。

这样，27.43就等于4.36+23.07了。

所以在这里特别要注意：

在有双交换发生的时候，计算图距时一定要加上2倍双交换值。

　　从任何一个三点测交的结果中，我们可以发现，所得的F2后代的8种可能的表型中，最多的2种是亲组合，最少的2种的双交换产物，中间数量的4种是单交换的产物。

根据这些规律，对于一个三点实验结果，在不计算重组值的情况下，一眼就能正确判断这三个基因的排列次序，即用双交换类型与亲本类型相比较，改变位置了的基因就是处于中间位置的基因。

在上面的例子中：

只有当Sh位于中间的时候，同时发生两个单交换后，才可能产生+sh+或c+wx的个体，所以这三个基因的顺序是c-sh-wx，这自然跟我们在计算重组值后所得的结论一致。

　　要注意的是，与两点实验一样，用三点实验必需要用三杂合体，因为如果不是杂合体，我们就无法判断是否发生了交换。

根据概率知识，我们知道对于两个独立事件，它们同时发生的概率等于各自概率的乘积。

对同一染色体上的三个基因来说，发生双交换的概率应该是两个单交换概率的乘积，在上面的例子中，理论上双交换率应为：

23.07%*4.36%=1.0%，可是它的实际双交换值只有0.96%，实际双交换值小于理论双交换值。

在这里实际值与理论值相差不是很大，而在有些例子中，理论双交换值与实际双交换值相差很大，譬如说理论双交换值为0.90%，可实际只有0.15%。

可见每发生一次单交换时，它的邻近基因间也发生一次交换的机会就会减少，这种现象称为干涉（interference）。

干涉的程度通常用并发系数（coefficientofcoincidence,c）来表示：

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　并发系数（c）=（实际双交换值）/（理论双交换值）

　　　　其中理论双交换值为两个单交换百分率的乘积。

　　并发系数在0-1之间。

如果并发系数=1，则说明两个单交换之间没有干涉；如果并发系数=0，则说明发生了完全干涉，也就是说第一个交换的发生完全干涉了第二个交换的发生，即没有双交换。

在上面的例子中，并发系数=0.96/1.0=0.96,干扰=1-0.96=0.04。

另外在微生物发生基因转变的时候，并发系数可以大于1，这表示存在负干涉（negativeinterference），即一次交换的发生使第二次发生交换的频率增加了。

　　以上讲的干涉是就一个完整的染色体为单位来说的，也叫染色体干涉（chromosomalinterference）。

我们知道，在减数分裂的前期，二价体是由4条染色单体组成的，交换并不限于某二条非妹妹染色单体之间，因而存在1-3、1-4、2-3、2-4各种不同形式的交换（A，B，C，D），在2-3之间已发生了一次交换的基础上，再发生2-3二线双交换、1-3三线双交换、2-4三线双交换和1-4四线双交换的机会是均等的。

如果在两条非姊妹染色单体之间的一次单交换会干涉其它非姊妹染色单体之间的交换，这叫做染色单体干涉（chromatidinterference），一般说来第一次交换仅对于2-3二线双交换有干涉，对其他类型的双交换没有干涉。

遗传学图（geneticmap）又称基因连锁图（linkagemap）或染色体图（chromosomemap），是一种依据基因之间的交换值（或重组值），表示连锁基因在染色体上相对位置的简单线性示意图。

通过一系列的三点测交或二点测交，我们可以把一对同源染色体上各基因的次序及相对距离标定出来，从而构成一个基因的连锁群。

所谓一个连锁群（linkagegroup）是指位于一对同源染色体上的所有基因群。

通过大量的实验我们已经知道一个生物连锁群的数目是等于或少于染色体的对数。

对于这一点很容易理解，因为基因位于染色体上，至于少于染色体数，那是因为有些连锁群还未被发现。

图10-4是果蝇的遗传学图，我们看到4个连锁群正好与4对染色体数相符。

基因在遗传学图上的位置叫座位（locus），一般以最先端的基因位置为0，如果发现有新基因在更先端的位置时，就把0点让给新基因，其余基因的位置亦作相应的移动。

在前面我们已经讨论，交换值介于0到50%，但在遗传学图上我们可以看到超过50图距单位的，这是因为在这两基因间发生了多次交换，但实际上这两基因间的重组值不会超过50%，所以由实验得到的重组值与图上的重组值不一定是一致的，因此要从图上知道基因间的重组值只限于邻近的基因座位间。

我们在这里所讲的遗传学图的界标是一些表型性状，Botstein等于1980年了提出现代遗传连锁图的概念，主要是将这些单纯的表型多态性界标改变为DNA序列的多态性作为界标，如RFLP、VNTR、STR、SNP等。

脉孢霉四分子及其遗传学分析

　利用脉孢霉（Neurosporacrassa）进行遗传学分析具有许多优点：

个体小，生长迅速，便于培养；具有象高等生物那样的染色体，研究结果可在遗传学上广泛应用；除无性繁殖外，还可进行有性繁殖，一次杂交可产生大量后代；其无性世代是单倍体，没有显隐性，基因型直接在表型上反映出来；一次只分析一个减数分裂的产物，而二倍体合子是两个不同减数分裂产生的配子相互结合的结果，只有通过测交实验才能分析减数分裂的结果，手续麻烦得多。

脉孢霉也叫红色面包霉（Neurosporacrassa），其生活史见上图。

脉孢霉是一种丝状真菌，它在培养基上象网状一样伸展生长，其单倍体世代是由多细胞菌丝体（mycelium）和分生孢子（conidium）所构成，由分生孢子萌发形成新的菌丝，这是它的无性世代。

在一般情况下，它这样循环往复地进行无性繁殖，这时都是进行有丝分裂，因而都是单倍体。

脉孢霉的有性过程是由两个不同的交配型（matingtype）菌丝通过原生质的融合和异型核的结合而形成二倍体的合子。

二倍体合子存在的时间很短，它们能迅速长成长形的子囊（ascus）。

每个子囊中的核都进行两次减数分裂，产生出4个单倍体的细胞核，再经一次有丝分裂形成8个核，每个核被厚膜所包围形成子囊孢子（ascospores）。

由此我们可以看出，每一个子囊中的8个子囊孢子是单一减数分裂的产物。

子囊孢子在适宜的环境中萌发，通过连续的有丝分裂产生新的菌丝体。

脉孢霉的合子在子囊内进行二次减数分裂所形成的4个子囊孢子叫四分子（tetrad），对四分子进行的遗传分析就叫四分子分析（tetradanalysis）。

由于脉孢霉的子囊很狭窄，以至分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴之中，所以在子囊里面进行分裂的细胞核是严格按直线顺序排列的，因此，在交配中，等位基因通过减数分裂所产生的细胞就呈现有规律的排列-顺序四分子（orderedtetrad）。

通过四分子分析，我们可以获得许多重要的对于遗传分析的直接资料，譬如我们可以取得分离规律的直接证据，可以检验到有无连锁和交换等。

如用产生红色菌丝的正常脉孢霉菌种与产生白色菌丝的变种交配，两个分生孢子的单核结合成为二倍体的合子，在子囊中进行减数分裂和有丝分裂，生成8个单倍的子囊孢子，在子囊未破裂之前将各子囊中的子囊孢子按顺序一个个地在显微镜下用很细的针剥离出来，进行分别培养而获得每个孢子的菌丝，结果将会见到每个子囊中有四个孢子长出红色菌丝，另外四个孢子长出白色菌丝，成1:

1的比例，这是由于等位基因在减数分裂时发生分离的结果，这样就更为直接地证明了分离规律。

假设在同源染色体上有一对等位基因A和a，如果在着丝点和这对等位基因之间没有发生过交换，那么在第一次减数分裂时A和a就完全分开进入不同的两极，第二次减数分裂时，染色单体分开，进入四个孢子，进一步的有丝分裂形成8个子囊孢子，8个子囊孢子呈AAAAaaaa（或aaaaAAAA）的排列方式，在这种方式中，A和a基因的分离发生在减数分裂的第一次分裂，我们将这种分离方式叫第一次分裂分离（firstdivisionsegregation，MI）。

当非姊妹染色单体在着丝粒和基因座（A,a）间发生交换时，在第一次减数分裂后，由于在这个过程中只有同源染色体的分离，因而等位基因A和a仍同时存在于同一核中，只有到减数分裂第二次分裂时，A和a才进入不同的核中，所以称这种情况为第二次分裂分离（second-divisionsegregation，MII），由此得到的等位基因的排列模式AAaaAAaa（或它的镜像排列aaAAaaAA）称为MII模式（图10-9）。

这种模式的特征是在一半的四分子产物中发生了重组，这种交换型排列模式还有可能出现AAaaaaAA（或aaAAAAaa），这是由于纺锤体的随机趋向所致，"A上a下"和"A下a上"或"A下a上"和"A上a下"都是随机的，而且它们的频率也大致相当。

我们知道染色体上两个基因座之间的距离愈远，则它们之间发生交换的频率愈高，因此当第二次分裂分离的子囊愈多，则说明有关基因和着丝粒的距离愈远。

所以根据第二次分裂分离子囊的频数，就可以计算出某一基因和着丝粒间的距离，这距离称为着丝粒距离（locus-to-centromeredistance）。

这种以着丝粒作为一个座位，计算某一基因与着丝粒的距离（重组值），叫着丝粒作图（centromeremapping）。

下面来看看如何进行着丝粒作图。

　　通过一个实例来说明，假设有两种不同接合型的脉孢霉菌株，一种是能合成赖氨酸的野生型菌株（记作+），该菌株成熟的子囊孢子呈黑色，另一种是赖氨酸缺陷型（记作-），这种菌株的子囊孢子成熟后呈灰色。

将这两种菌株进行杂交（+×-），根据黑色孢子和灰色孢子的排列次序，杂种子囊中减数分裂的产物共有6种子囊型，其计数的结果见表（表丢了，精神领会就行了。

）

　　表中1和2、3和4、5和6子囊中的子囊孢子的排列方式是互为镜影的，这说明减数分裂是一个交互过程。

凡属第一次分裂分离的子囊，均是着丝粒和所研究的基因间末发生过交换的，所以称作非交换型，如子囊型1和2，其基因座的分离方式为2:

2。

子囊型3、4、5和6均属于第二次分裂分离的子囊，它们在减数分裂后形成的子囊孢子的排列顺序是+_+_（或_+_+）（基因座的分离方式为1:

1:

1:

1）以及+__+（或_++_）（基因座的分离方式为1:

2:

1）。

由此可见，凡是第二次分裂分离的子囊，一定是在着丝粒与所研究的基因之间发个过交换的，故MII型也称作交换型。

根据以上分析，合成赖氨酸的基因与着丝粒间的重组值为：

　　即合成赖氨酸的基因与着丝粒间的图距为7.3cM。

以上讲的是一对基因的四分子分析，下面我们来看看二对基因的四分子分析。

在二对基因杂交时，如果只考虑性状的组合，而不考虑孢子排列的顺序，可以将子囊分为下列三种类型：

1、亲二型（parental-ditype，PD）：

2种基因型都跟亲代一样；

2、非亲二型（nonparental-type，NPD）：

2种基因型都跟亲代不一样，是重组型；

3、四型（tetratype，T）：

4种基因型，2种跟亲代一样，2种跟亲代不一样。

通过四分子分析，可以帮助我们确定二对基因之间是否连锁。

当二对基因位于不同的染色体上时，由图10-12可以看到，在没有交换时，亲二型（PD）和非亲二型（NPD）各占50%；在发生交换时产生四型（T），其中亲本类型和重组类型也都是各占50%。

因此总的来说，当二对基因位于不同的染色体上时，重组类型占50%，亲本类型占50%，这符合自由组合规律。

也就是说当亲二型的频率与非亲二型的频率相等时（PD=NPD），我们可以说两个基因是自由组合的。

　　当二对基因位于同一染色体上即这两对基因连锁时，产生亲二型和非亲二型四分子的频率是不一样的。

如果在二个基因之间没有交换，将产生PD型子囊（图a）；如果在二个基因之间发生一个单交换，将产生T型子囊（图b）；如果在二基因之间发生二线双交换，由于没有重组子代的产生，仍为PD型子囊（图c）；如果在二基因之间发生三线双交换，因涉及到四条染色体中的三条，则会有两种不同的方式，2-3,4（或1-3,4）三链双交换和3-1,2（或4-1,2）三链双交换，但都产生T型子囊（图d）；如果在二基因之间发生四线双交换，将产生NPD型子囊（图e）。

综上所述，亲二型（PD）是通过非交换和二线双交换而产生的，非亲二型（NPD）仅仅通过四线双交换产生，而四线双交换只是四种可能的双交换之一（见图10-13c,d,e），非常之少。

因此如果亲二型的频率远大于非亲二型的频率（即PD>>NPD），我们可以说两个基因是连锁的。

　　一旦我们知道两个基因是连锁的，以及我们知道了每一种减数分裂四分子类型的相对数目，通过下述公式我们就可以算出两个基因间的距离：

　　其中：

重组子数目=１/２T+NPD，非重组子数目（即亲本型数目）=１/２T+PD。

细菌的遗传分析与基因定位

由于细菌结构简单，世代周期短，通常20分钟一代，而且容易获得各种类型的突变型如合成代谢功能突变型、分解代谢功能突变型、抗性突变型等，所以自20世纪40年代以来细菌已成为遗传学研究中最常用的实验材料。

　　细菌不但可在液体培养基上生长，也能在琼脂固体培养基上生长。

在固体培养基上，我们可以观察到由单个细胞长成的菌落，细菌的遗传分析通常是在这样的固体培养基上进行的。

　　细菌属于原核生物（prokaryotes），没有明显的细胞核，不进行减数分裂，其基因的传递方式是非减数分裂式的。

细菌的染色体是裸露的，它比较容易接受带有相同或不相同物种的基因或DNA片段的插入。

细菌之间遗传物质的转移主要有以下三种方式：

转化、接合和转导。

　　转化（transformation）是指通过外源DNA进行的遗传物质的转移。

转化可以分为自然转化（naturaltransformation）--细菌能自然地吸收DNA及遗传转化，和工程转化（engineeredtransformation）-通过遗传改变使细菌能吸收DNA及进行遗传转化。

　　接合（conjugation）是指由供体菌（donor）和受体菌（recipient）之间的直接接触而导致的遗传物质的单向转移。

　　转导（transduction）是指以噬菌体为媒介所介导的DNA从供体菌到受体菌的转移。

　　自从Avery等于1944年发现肺炎双球菌的转化作用后，发现转化作用在细菌中是非常普遍的现象。

但是对于某些细菌如枯草杆菌来说容易被转化，而另一些细菌如野生型大肠杆菌就不容易转化，因为这些菌所产生的一些酶很容易将外来的DNA降解，后来经过科学家的探索，发现用一些化学试剂处理后可增加细胞膜对DNA的渗透性，目前在基因工程中就是利用这种方法来转化E.coli的。

不管是自然转化还是工程转化，在一次实验中只可能是一小部分细胞（约1%）能够真正吸收外源DNA。

转化时供体细菌DNA断裂成小片段，这些片段的平均长度约为20000个核苷酸对，当外源DNA一旦被不同遗传型组成的受体菌所吸收，外源DNA片段可以和染色体形成部分二倍体，也可能与受体菌染色体之间发生重组，从而使受体细胞发生稳定性的遗传转化。

下面以枯草杆菌的自然转化为例说明转化的过程：

供体DNA片段带有野生型a+基因（相对于受体菌而言），在DNA的吸收过程中，双链DNA中的1个链被降解，因此最后在细胞内仅能发现1个完整的线状DNA链，这条单链与受体细胞内的环状染色体上的同源DNA配对，形成一个三链结构，在三链之间发生双交换从而发生重组，结果产生一重组受体染色体：

在两个交换之间的区域，一个DNA链带有供体的a+DNA片段，另一条链带有受体的aDNA片段（产生的另一条链被降解），在受体染色体复制一轮后，其中一个染色体的二条链都带有a+，即成为a+的转化子，另一子代为a非转化子，它们产生的频率是相同的。

　　通过转化技术我们可以判断所转化的两个基因是连锁的还是独立遗传的，其中一个可靠的证据是观察当DNA浓度降低时转化频率的改变：

如果当DNA浓度下降时，AB共转化（cotransformation）的频率下降和A或B转化频率下降程度相同，则说明A和B是连锁的；如果AB转化频率的下降将远远超过A或B转化频率的下降程度，则说明A和B是不连锁的。

这种方法的原理是这样的：

在较低的浓度范围内，DNA浓度与转化频率成正比关系，假如两个基因在同一分子上，那么浓度降低10倍时，两个基因同时转化的频率也将减少10倍；但是如果两个基因在不同的DNA片段上，那么DNA浓度下降10倍时，两个基因共转化的概率将减少100倍（10*10），而不是10倍，由此可以确定A和B之间是否连锁。

在确定了基因的连锁关系之后利用转化我们可以进一步作图。

例如，如果基因p和q是经常共转化的，基因q和o也是经常共转化的，但基因o和p从不能共转化，那么基因的顺序一定是p-q-o。

　　如果已知几个基因之间是紧密连锁的，我们也可以通过转化来计算重组值。

例如Nester等用枯草杆菌的一个菌株trp2+his2+tyr1+作为供体，提取其DNA向受体trp2＿his2＿tyr1＿菌株进行转化，结果如表4-7所示。

从表可以看出，数目最多的转化子（11940）是3个座位同时被转化的类型，这说明所研究的3个座位在染色体上是紧密连锁的。

由表中计算的结果表明，3个基因的次序是trp2－his2－tyr1。

表10-6　供体trp2+his2+tyr1+向受体菌trp2＿his2＿tyr1＿转化的结果及重组值的计算

　　细菌主要是无性繁殖，直到1946年JLederberg和ETatum发现不同品系的大肠杆菌间可以杂交并进行基因重组，人们才注意到大肠杆菌也存在“性别”差异。

　　下面我们先来看看1946年Lederberg和Tatum的一个实验：

大肠杆菌K12中有两个菌株A和B，菌株A需要在培养基中补充甲硫氨酸met和生物素bio，同时为链霉素敏感，菌株B需要在培养基中补充苏氨酸thr、亮氨酸leu和硫胺素thi，同时为抗链霉素突变型，这种必须在培养基中添加某些物质才能生长的细菌叫营养缺陷型（auxotroph），相对于缺陷型的野生型菌株则不需要添加任何附加物，叫原养型（prototroph）。

对这几个性状而言，原养型菌株及A、B突变型菌株的基因型分别是：

　　原养型菌株：

met+bio+thr+leu+thi+。

　　A菌株：

met-bio-thr+leu+thi+。

　　B菌株：

met+bio+thr-leu-thi-。

若将菌株A、B分别涂在基本培养基上，则均不能产生任何菌落，若将A和B混合培养在含以上五种成分的培养基上，几小时后，离心沉淀物，把沉淀物洗涤后涂布在基本培养基上，发现长出了少数菌落（野生型），频率为10-7。

但是E.coli许多生化突变型回复突变的频率也是10-7，那么这少数菌落是不是由于基因突变呢？

答案是否定的，因为菌株A要回复突变成野生型的话，有2个基因需同时发生回复突变，其概率只有10-7×10-7=10-14；同理，若菌株B要回复突变成野生型的话，其概率只有10-7×10-7×10-7=10-21，这与重组子出现的频率相差太远。

因此从这个结果表明在两个菌种间发生了遗传物质的交换。

为了证明这种遗传物质的交换是否需要细胞与细胞间的接触，BDavis设计了一种U型管，中间用过滤器隔开，滤器的孔很小，使细菌不能通过，但培养液和营养物质可以通过，在U型管的一臂添加菌株A，另一臂添加菌株B，然后在一端加压力或吸力，使培养液在两臂间流通，经几小时培养后，分别在固体培养基上添平板，未见有菌落的出现，即没有产生重组子。

由此说明这种遗传交换不可能是由于细胞破碎产生的转化因子DNA或从细胞中分泌的某些物质后产生的，而需要两个菌株间的直接接触。

换句话说，大肠杆菌也有某种类型的交配系统，这种交配系统能够实行菌与菌之间遗传物质的交换，我们叫这一系统为接合（conjugation）。

以上实验为接合的研究奠定了基础，那么在细菌中这种遗传物质的交换是单向的还是双向的呢？

　WHayes在1953年做了这样一个杂交实验，他同样用大肠杆菌K12的菌株A和菌株B，首先他用高剂量的链霉素处理菌株A或菌株B（用链霉素处理菌株可以阻碍细菌的分裂，但并不杀死它们），把处理过的菌株A跟未处理过的菌株B混合，或把处理过的菌株B跟未处理过的