缓冲液的配制方法.docx

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缓冲液的配制方法

核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法

50XTAEBuffer（pH8.5）

组份浓度2MTris-醋酸，100mMEDTA

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯中

Tris

242g

Na2EDTA2H2O

37.2g

2•向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3.加入57.1ml的乙酸，充分搅拌。

4•加去离子水将溶液定容至IL后，室温保存。

10XTBEBuffer（pH8.3）

组份浓度890mMTris-硼酸，20mMEDTA

配制量1L

配制方法l.称量下列试剂，置于IL烧杯中。

Tris

108g

Na2EDTA2H2O

7.44g

硼酸

55g

2•向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3•加去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。

10XM0PS（3-吗啉基丙磺酸）Buffer

组份浓度200rnMMOPS,20mMNaOAc,10mMEDTA

配制量1L

配制方法1.称41.8gMOPS，置于1L烧杯中。

2.加约700mlDEPC处理水，搅拌溶解

3.使用2NNaOH调节pH值至7.0。

4.再向溶液中加入下列试剂。

1MNaOAc（DEPC处理）

20ml

0.5MEDTA（pH8.0）（DEPC处

20ml

理）

5.用DEPC处理水将溶液定容至1L

6.用0.45m滤膜过滤除去杂质。

7.室温避光保存。

注：

溶液见光或高温灭菌后会变黄。

变黄时也可使用，但变黑时不要使用

溴乙锭（10mg/ml）

组份浓度10mg/ml溴乙锭

配制量100ml

配制方法1.称量1g溴乙锭，加入到100ml容器中。

2.加入去离子水100ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭

3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。

4.溴乙锭的工作浓度为0.5g/ml

注意：

溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作

Agarose凝胶

配制方法1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（通常是0.5XTBE或1X

TAE）。

2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶

中。

3.加入一定量的电泳缓冲液（总液体量不宜超过锥形瓶的50%容

量）。

注：

用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。

4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中

加热熔化琼脂糖。

加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。

小心摇动锥形瓶。

使琼脂糖充分均匀熔化。

此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。

必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造

成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。

熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清。

5.使溶液冷却至60C左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液（终浓度0.5卩g/ml）。

并充分混匀。

注：

溴乙锭是一种致癌物质。

使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好

手套

6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。

凝胶厚度一般在3~5min之间。

7.在室温下使胶凝固（大约30min~1h），然后放置于电泳槽中进行电泳。

注：

凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4C下保存,一般可保存2~5天。

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围

琼脂糖浓度

最佳线形DNA分辨范围（bp）

0.5%

1,000~30,000

0.7%

800~12,000

1.0%

500~10,000

1.2%

400~7,000

1.5%

200~3,000

2.0%

50~2,000

6xLoadingBuffer（DNA电泳用）

组份浓度

30mM

EDTA

36%（V/V）

Glycerol

0.05%（W/V）

XyleneCyanoIFF

0.05%（W/V）

BromophenolBlue

配制量500ml

配制方法1.称量下列试剂，置于500ml烧杯中

EDTA

4.4g

BromophenolBlue

250mg

XyleneCyanolFF

250mg

2•向烧杯中加入约200ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解。

3.加入180ml的甘油（Glycerol）后，使用2NNaOH调节pH值

至7.0

4•用去离子水定容至500ml后，室温保存。

10xLoadlngBuffer（RNA电泳用）

组份浓度

10mM

EDTA

50%（V/V）

Glycerol

0.25%（W/V）

XyleneCyanoIFF

0.25%（W/V）

BromophenolBlue

配制置10ml

配制方法1.称量下列试剂，置于10ml离心管中

0.5MEDTA（pH8.0）

200卩1

BromophenolBlue

25mg

XyleneCyanolFF

25mg

2.向离心管中加入约4ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解

3.加入5ml的甘油（Glycerol）后，充分混匀。

4.用DEPC处理水定容至10ml后，室温保存。

四、核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法

20XSSC

组份浓度3.0MNaCl,0.3MNa3citrate2H2O（柠檬酸钠）

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于IL烧杯中。

NaCl

175.3g

Na3citrate2H2O

88.2g

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3滴加14NHCI，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容

至1L。

4.咼温咼压火菌后，室温保存。

20XSSPEBuffer

组份浓度3.0MNaCl，0.2MNaH2PO4，0.02MEDTA

配制量1.L

配制方法1.称量下列试剂，置于IL烧杯中。

NaCl

175.3g

NaH2PO4H2O

27.6g

Na2EDTA2H2O

7.4g

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3.加NaOH调节pH值至7.4（约6.5ml的10NNaOH）。

4•加去离子水将溶液定容至IL。

5.咼温咼压火菌后，室温保存。

50XDenhardt'S溶液

1%（W/V）

Ficoll400（菲可400/水溶性聚蔗糖

400）

1%（W/V）

PolyvinyIpyrrolidone

（聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮）

1%（W/V）

BSA

组份浓

度

500ml

配制方法1.称量下列试剂，置于500ml烧杯中

Flcoll400

5g

PoLyvlnyIpyrrolldone

5g

BSA

5g

2.加去离子水约400ml，充分搅拌溶解

3.加去离子水将溶液定容至500ml。

4.用0.45yn滤膜过滤后，分装成每份25ml

5.-20C保存。

0.5M磷酸盐Buffer

组份浓度0.5MNa2HPO4。

配制量IL

配制方法1.称量134gNa2HPO47H2O置于IL烧杯中。

2.加入约800ml的去离子水充分搅拌溶解。

3.加入85%的H3PO4（浓磷酸）调节溶液pH值至7.2

4.加去离子水定容至1L。

5.咼温咼压火菌后，室温保存。

SalmonDNA（鲑鱼精DNA）

组份浓度10mg/mlSalmonDNA

配制量约100ml

配制方法1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中，加入约200ml的TEBuffer。

2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h，溶解后加入4ml的5MNaCl,使其终浓度为0.1M。

3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。

4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20

次，以切断DNA。

5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀

6•离心回收DNA后，溶解于100ml的去离子水中。

测定溶液的OD260值。

7•计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10mg/ml。

8•煮沸10min后，分装成小份（1ml/份）。

-20C保存。

9.使用前在沸水浴中加热5min后，迅速冰浴冷却。

DNA变性缓冲液

组份浓度1.5MNaCl,0.5MNaOH

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于IL烧杯中

NaCl

87.7g

NaOH

20g

2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3.加去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。

6x

SSC（或SSPE）

5x

Denhardt's

0.5%（W/V）

SDS

100卩g/ml

SalmonDNA

预杂交液/杂交液（DNA杂交用）

组份浓

度

配制置100ml

配制方法1.称量下列试剂，置于200ml烧杯中

20XSSC（或SSPE）

30ml

50XDenhardt's

10ml

10%SDS

5ml

10mg/mlSalmon

1ml

DNA

dH2O

54ml

2.充分混匀后，使用0.45ym滤膜滤去杂质后使用

预杂交液/杂交液（RNA杂交用）

组份浓度

6X

SSC（或SSPE）

5X

Denhardt‘s

0.5%（W/V）

SDS

100g/ml

SalmonDNA

50%（V/V）

Formamlde

配制量

100mL

配制方法

1.称量下列试剂，置于200

ml烧杯中。

20XSSC（或SSPE）

30ml

50XDenhardt's

10ml

10%SDS

5ml

10mg/mlSalmon

1ml

DNA

Formamide（甲酰胺）

50ml

dH20

4ml

2.充分混匀后，使用0.45yn滤膜滤去杂质后使用

膜转移缓冲液（Western杂交用）

组份浓度39mMGlycine,48mMTris,0.037%（W/V）SDS,20%（V/V）

甲醇

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于IL烧杯中。

Glycine

2.9g

Tris

5.8g

SDS

0.37g

2.向烧杯中加入约600ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.加去离子水将溶液定溶至800ml后，加入200ml的甲醇

4.室温保存。

TBSTBuffer（Western杂交膜清洗液）

组份浓度20mMTris-HCI,150mMNaCI,0.05%（V/V）Tween20

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于IL烧杯中。

NaCl

8.8g

1MTris-HCI（pH8.0）

20ml

2•向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3.加入0.5mlTween20后充分混匀。

4•加去离子水将溶液定容至lL后，4C保存。

封闭缓冲液（Western杂交用）

组份浓度5%（W/V）脱脂奶粉/TBSTBuffer

配制量100ml

配制方法1.称5g脱脂奶粉加入到100mlTBSTBuffer中，充分搅拌溶解

2.4C保存待用（本封闭液应该现配现用）。

五、实验室常用培养基的配制方法

Ampicillin（氨卡青霉素）（100mg/ml）

组份浓度100mg/mlAmpicillin

配制量50ml

配制方法1.称量5gAmpicillin置于50ml离心管中。

2.加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml

3.用0.22卩过滤膜过滤除菌

4•小份分装（1ml/份）后，-20C保存。

IPTG（异丙基-B-D-硫代半乳糖苷）（24mg/ml）

组份浓度24mg/mLIPTG

配制量50mL

配制方法1.称1.2gIPTG置于50ml离心管中。

2.加入40ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50ml

3•用022卩过滤膜过滤除菌。

4小份分装（1ml，份）后，-20C保存。

X-Gal（20mg/ml）

组份浓度20mg/mlX-Gal

配制量50ml

配制方法1.称量IgX-Gal置于50ml离心管中。

2.加入40mlDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，定容至50

ml。

3.小份分装（1ml/份）后，-20C避光保存。

ID拉差甘

LB培养基

组份浓度1%（W/V）Tryptone（胰蛋白胨），0.5%（W/V）YeastExtract（酵母提

取物），1%（W/V）NaCI

配制量

配制方法1.称取下列试剂，置于IL烧杯中

Tryptone

10g

YeastExtract

5g

NaCl

10g

2•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴力卩5NNaOH（约0.2ml），调节pH值至7.0。

4.加去离子水将培养基定谷至1Lo

5咼温咼压火菌后，4。

C保存。

LB/Amp培养基

组份浓度

1%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

1%（W/V）

NaCl

0.1mg/ml

Ampicillin

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中

Tryptone

10g

YeastExtract

5g

NaCl

10g

2•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3.滴力卩5NNaOH（约0.2mL）。

调节pH值至7.0。

4.加去离子水将培养基定谷至1Lo

5.咼温咼压火菌后，冷却至室温。

6.加入1mlAmpicillin（100mg/ml）后均匀混合。

7.4C保存。

TO拉差甘

IB培养基

组份浓度

1.2%（W/V）

Tryptone

2.4%（W/V）

YeastExtract

0.4%（V/V）

Glycerol

17mM

KH2PO4

72mM

K?

HPOa

配制量1.L

配制方法1.配制磷酸盐缓；中液（0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4）100ml溶解2.31gKH2PO4和254gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后，加去离子水定容至100ml，咼温咼压火菌。

2.称取下列试剂，置于lL烧杯中。

Tryptone

12g

YeastExtract

24g

Glycerol

4m

3.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

4.加去离子水将培养基定容至1L后，咼温咼压火菌。

5•待溶液冷却至60C以下时，；加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓

冲液。

6.4C保存。

TB/Amp培养基

组份浓度

1.2%（W/V）

Tryptone

2.4%（W/V）

YeastExtract

0.4%（V/V）

Glycerol

17mM

KH2PO4

72mM

K2HPO4

0.1mg/ml

Ampicillin

配制量1L

配制方法1.配制磷酸盐缓冲液（0.17MKH2PO4,0.72MK2HP04）100ml

溶解2.31gKH2PO4,和12.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,

搅拌溶解后，加去离子水定容至100ml，咼温咼压火菌。

2.称取下列试剂，置于IL烧杯中。

Tryptone

12g

YeastExtract

24g

Glycerol

4ml

3•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

4.加去离子水将培养基定容至IL后，咼温咼压火菌。

5•待溶液冷却至60C以下时，加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。

6.均匀混合后4C保存。

SOB培养基

组份浓度

2%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

0.05%（W/V）

NaCI

2.5mM

KCI

10mM

MgCI2

配制量1L

配制方法1.配制250mMKCI溶液。

在90ml的去离子水中溶解I.86gKCI后，定容至100ml。

2.配制92MMgCI2溶液。

在90mI去离子水中溶解19gMgCI2后，定容至100mI，高温

咼压火菌。

3•称取下列试剂，置于IL烧杯中

Tryptone

20g

YeastExtract

5g

NaCl

0.5g

4•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

5.量取10ml250mMKCI溶液，加入到烧杯中。

6.滴加5NNaOH溶液（约0.2ml），调节pH值至7.0。

7.加入去离子水将培养基定谷至lLo

8.高温高压灭菌后，4C保存。

9.使用前加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。

SOC培养基

组份浓度

2%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

0.05%（W/V）

NaCl

2.5mM

KCl

10mM

MgCl2

20mM

Glucose

配制量100mL

配制方法1.配制lMGlucose溶液。

100

将18gGlucose溶于90ml去离子水中，充分溶解后定容至

ml。

用0.22

ym滤膜过滤除菌

2.向I00mlSOB培养基中加入除菌的1MGlucose溶液2ml,

均匀混合。

3.4C保存。

组份浓度1.6%（WV）Tryptone,1%（W/V）YeastExtract,0.5%（W/V）NaCI

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中

Tryptone

16g

YeastExtract

10g

NaCl

5g

2•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3.滴力卩5NNaOH，调节pH值至7.0。

4.加去离子水将培养基定谷至1Lo

5.咼温咼压火菌后，4C保存

①bxbroth

组份浓度2%（W/V）Tryptone，0.5%（W/V）YeastExtract，o

5%（W/V）MgSO47H2O

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于lL烧杯中

Tryptone

20g

YeastExtract

5g

MgSO47H2O

5g

2•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解

3.滴加1NKOH。

调节pH值至7.5。

4.加去离子水将培养基定谷至1Lo

5.咼温咼压火菌后，4C保存

NZCYM培养基

组份浓度

0.5%（WV）

YeastExtract

0.1%（WV）

CasaminoAcid（酪蛋白氨基酸）

1%（WV）

NZ胺

0.5%（WV）

NaCl

0.2%（WV）

MgSO47Ho

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂。

置于IL烧杯中

YeastExtract

5g

CasaminoAcid

1g

NZ胺

10g

NaCl

5g

MgSO47Ho

2g

2•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴力卩5NNaOH（约0.2ml），调节pH值至7.0。

4.加去离子水将培养基定谷至1Lo

5.咼温咼压火菌后，4C保存

NZYM培养基

组份浓度

0.5%（WV）

YeastExtract

1%（WV）

NZ胺

0.1%（WV）

NaCl

0.2%（WV）

MgSO47Ho

配制方法NZYM培养基除不含CasaminoAcid夕卜，其他成份与NZCYM培

养基相同。

NZM培养基

组份浓度

1%（WV）

NZ胺

0.1%（WV）

NaCl

0.2%（WV）

MgSO47Ho

配制方法NZM培养基除不含YeastExtract（酵母提取物）外，其他成份与

NZYM培养基相同。

一般固体培养基的配制

配制方法1.按照液体培养基配方准备好液体培养基，在高温高压灭菌前，加

入下列试剂中的一种。

Agar（琼脂；铺制平板用）

15g/L

Agar（琼脂；配制顶层琼脂用）

7g/L

Agarose（琼脂糖；铺制平板用）

15g/L

Agarose（琼脂糖；配制顶层琼脂用）

7g/L

2•高温高压灭菌后，戴上手套取出培养基，摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀（此时培养基温度很高，小心烫伤）。

3.待培养基冷却至50~60°C时，加入热不稳定物质（如抗生素等），摇动容器充分混匀。

4.铺制平板（30~35ml培养基/90mm培养皿）。

LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基

组份浓度

1%（W/V）

Tryptone

0.5%（W/V）

YeastExtract

1%（W/V）

NaCl

0.1mg/ml

Ampicillin

0.024mg/ml

IPTG

0.04mg/ml

X-GaL

1.5%（W/V）

Agar

配制量1L

配制方法1.称取下列试剂，置于IL烧杯中

Tryptone

10g

YeastExtract

5g

NaCl

10g

2•加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

3.滴力卩5NNaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0。

4•加去离子水将培养基定容至1L后，加入15gAgar。

5.高温高压灭菌后，冷却至60C左右。

6.加入1mlAmpicillin（100mg/ml）、1mlIPTG（24mg/ml）、2

mlX-Gal（20mg/mL）后均匀混合。

7.铺制平板（30~35ml培养基/90mm培养皿）。

8.4C避光保存。

TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基

组份浓度

1.2%（W/V）

Trypt