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wolf论文
【摘要】：
补血草是一种耐干旱和盐碱的植物，含有的化学成分十分复杂，其中包括金属硫蛋白。
金属硫蛋白是由微生物和植物产生的金属结合蛋白，富含半胱氨酸的短肽，对多种重金属有高度亲和性。
它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。
与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。
本实验通过将补血草处于盐胁迫条件下，使其相关的抗逆基因大量表达，进而把全RNA反转录（得到cDNA）,通过基因特异性引物，PCR扩增金属硫蛋白基因MT16、MT42、MT82，导入到T载体中，转入DH5α大肠杆菌扩增，提取质粒后，测序验证目的基因，然后再l连入PGEX4T-1载体中，构建金属硫蛋白的原核表达载体，重组载体转入BL21大肠杆菌中，在含有重金属的平板上点菌，通过观察菌株的生长状况来研究MT基因表达与重金属耐受性间的联系。
【关键词】：
补血草金属硫蛋白PGEX4T-1载体过量表达载体
Abstract：
Limonium,aplantresistanttodroughtandsalinity,hasmanyspecialgenesrelatedwiththeresponsetodroughtandsalinity,includingthemetallothionein.Metallothioneinproducedbymicroorganismsandplantmetal-bindingprotein,cysteine-richpeptides,hashighaffinityforheavymetals.Itisalowmolecularweight,cysteineresiduesandhighmetalcontentoftheprotein.Combinedwiththemetalismainlycadmium,copperandzinc,widelypresentinvariousorganismsfrommicrobestohumans,itshighlyconservedstructure.
Inthisexperiment,metallothioneingeneMT16,MT42,MT82fromLimoniumsinensewasclonedandusedtoconstructMT:
:
PGEX4T-1fusion-expressionvector.andthen,fusion-expressionvectorwasimportedintoEscherichiacoliBL21,andusedtoobservethegrowthconditionsonmediumcontainingheavymetalstostudygenefunction.
keywords：
LimoniummetallothioneinPGEX4T-1fusion-expressionvector
目录
【摘要】：
1
【关键词】：
1
Abstract2
keywords：
2
目录3
1简介4
1.1补血草简介4
1.1.1补血草植物资源介绍4
1.1.2补血草属植物化学成分4
1.1.3补血草属植物资源药用价值5
1.2金属硫蛋白简介5
1.2.1金属硫蛋白定义5
1.2.2植物金属硫蛋白的基本功能5
1.2.3植物金属硫蛋白的特性6
1.2.4.植物MT分类6
1.2.5植物金属硫蛋白的应用前景7
2实验材料与方法7
2.1实验仪器、材料和试剂7
2.1.1实验仪器7
2.1.2实验材料8
2.1.3试剂8
2.2实验步骤10
2.2.1植物材料的处理10
2.2.2补血草总RNA的提取10
2.2.3反转录10
2.2.4PCR扩增目的基因11
2.2.5目的片段连接到T载体上12
2.2.6大肠杆菌超级感受态细胞的制备12
2.2.7连接产物转化大肠杆菌感受态细胞13
2.2.8碱裂解法提取质粒13
2.2.9质粒酶切检测13
2.2.10将检测有目的片段的重组质粒送测序公司测序14
2.2.11目的片段回收18
2.2.12将测序正确的目的片段导入表达载体PGEX4T-118
2.2.13将连接了目的基因的PGEX4T-1载体转入DH5a大肠杆菌19
2.2.14将连接产物转化到BL21大肠杆菌感受态细胞中19
2.2.15保菌、提取质粒19
2.2.16将质粒酶切检测目的片段19
2.2.17将保存的菌种划板纯化20
2.2.18细菌扩增后在含有重金属盐离子的平板上点菌20
3.实验结果与讨论21
3.1补血草总RNA提取结果21
3.2PCR产物分析21
3.3连接T载体后从大肠杆菌中提取的质粒电泳图22
3.4连接T载体后提取质粒酶切电泳检测图24
3.5导入BL21大肠杆菌中提取质粒电泳图25
3.6连接PGEX4T-1后质粒酶切产物验证图25
3.7细菌扩增后在含有重金属盐离子的平板上点菌结果图27
致谢29
参考文献30
1简介
1.1补血草简介
1.1.1补血草植物资源介绍
补血草是白花丹科Plumbaginaceae补血草属LimoniumMill植物，我国约有17~18种，主要分布于西北、东北和华北，新疆、甘肃、内蒙古和宁夏等省[1]。
该属植物极耐干旱和盐碱，生命力强，常分布于沙漠、戈壁滩、盐化草甸、石质山坡、流动沙丘等生境，现主要用于药用和观赏[2]。
其中我国最常见的补血草属植物为中华补血草Limoniumsinense（Girard）Kuntz和二色补血草Limoniumbicolor（Bge.）Kuntz.[3]。
1.1.2补血草属植物化学成分
补血草属植物含有氨基酸、无机元素、维生素、黄酮类、鞣质、多糖、生物碱、有机酸等多种成分，化学成分十分复杂[4-5]。
此外,补血草属植物还含有一定量的生物碱、有机碱、脂肪族化合物等[6]。
1.1.3补血草属植物资源药用价值
大量临床和药理研究证明了补血草属植物具有补血、止血功效，同时初步探明了其作用机制[7-8]。
中华补血草还用于制备抗肿瘤药物，二色补血草是一种安全、有效、无毒副作用的止血药[9]。
长期以来，补血草植物属植物临床和药理研究主要集中在其补血止血、抗菌消炎等方面[10]，而最新研究显示该属植物还具有抗癌、护肝、抗病等多种药理活性[11]。
1.2金属硫蛋白简介
1.2.1金属硫蛋白定义
早期研究发现：
金属硫蛋白（metallothionein）是由微生物和植物产生的金属结合蛋白，富含半胱氨酸的短肽，对多种重金属有高度亲和性。
它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。
与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守[12]。
1957年，美国科学家Margoshoes在研究镉的生物学作用时，首次从马肾细胞中分离了一种含有大量镉的低分子量的蛋白质，即金属硫蛋白[13]。
此后，在动物、植物、真菌和蓝细菌中均有发现结构相似的蛋白，而且其理化性质基本一致。
植物金属硫蛋白最早是由Casterline和Bamett于1977年从大豆根中发现的。
目前金属硫蛋白在肿瘤的发生、发展及预后治疗中的作用愈来愈受到各国学者的关注。
1.2.2植物金属硫蛋白的基本功能
由于大多数植物的金属硫蛋白没有得到纯化，对其功能的研究还处于起步阶段，目前所谈论的功能多是根据其表达行为推测出来的。
一般认为，植物金属硫蛋白在重金属解毒、活性氧的清除、金属离子的运输以及动态平衡的维持等方面有作用[14]。
（1）清除体内自由基的功能：
金属硫蛋白具有特殊的结构，其中的金属具有动力学不稳定性，巯基具有亲核性质，使金属硫蛋白易于和某些亲电性物质结合，特别是某些自由基，可达到消除自由基的目的。
1985年，Thornalley和Vasak发现金属硫蛋白有较强的清除-OH的作用，巯基可与-OH发生反应：
2-Sh+2-OH→-S-S-+2H2O，从而降低-OH对植物的毒害作用[15]。
（2）对重金属的解毒作用：
金属硫蛋白的巯基含量高，对重金属的亲和力大，对Cu、Zn、Pb、Ag、Hg、Cd等都有螯合作用。
巯基与重金属离子结合后排除体外，从而实现解毒功能。
金属硫蛋白分子中不含α-螺旋和β-折叠，但存在一种坚固的构象。
研究表明，其三级结构有α、β两个结构域，α结构域优先结合Cd2+和Hg2+，β结构域优先结合Cu2+[16]。
（3）金属离子的储存和运输功能：
Garcia-Hernandez等对拟南芥MT1a进行RNA原位杂交的结果显示，MT1a在维管束及运输营养物质的组织中大量表达，说明MT1a可能在金属离子的运输过程中起作用。
（4）近年来,MT对脏器纤维化和肿瘤疾病的发生与凋亡调控的密切联系成为医药研究领域的热点问题,提示MT有可能成为新的创新药物防治的关键靶点[17]。
1.2.3植物金属硫蛋白的特性
由于现已克隆到的植物基因多为cDNA因而对其基因组结构的了解还很有限。
植物金属硫蛋白的主要特性有：
（1）分子量低，一般为6～7kD；
（2）半胱氨酸含量较高，约占全部氨基酸残基的1/3；（3）不含组氨酸和芳香族氨基酸残基；（4）金属含量高，半胱氨酸残基上的-SH可以和Zn、Cd、Hg、Cu等近20种金属离子配位结合；（5）具有广泛的存在性及高效的可诱导性，许多内源和外源激素均可诱导金属硫蛋白合成[18]。
1.2.4.植物MT分类
金属硫蛋白（以下简称MT）根据半胱氨酸残基的分布，总体分为两大类型:
I类MT，这种类型MT含有与哺乳动物MT相同的高度保守的20个半胱氨酸；Ⅱ类MT，来自植物、真菌、无脊椎动物的MT属于这一类型。
根据半胱氨酸在金属硫蛋白中排列方式不同，Cobbett等人将植物MT分为以下四种类型:
1.MT-1:
由6个cys-xaa-cys（Xaa表示另外一种氨基酸）基团平均分布于两个结构域中，两个结构域中间被40个氨基酸间隔，其中包括芳香族氨基酸。
来自于各种十字花科植物的MT-1具有很多特点，比如两结构域间距离较短，并有额外的半胱氨酸残基等。
2.MT-2:
由两个富含半胱氨酸的结构域组成，中间由40个氨基酸残基分开，但是第一对半胱氨酸以Cys-Cys基团位于氨基酸序列的第三到第四个氨基酸之间，一个Cys-Gly-Gly-Cys基团出现于N末端的半胱氨酸富集区。
整体上看，MT-2N末端具有高度保守的MSCCGGNCGCS序列，C末端含有三个Cys-Xaa-Cys基团。
比较来讲，在不同植物种类之间，中间区域的变化较大[19]。
3.MT-3:
蛋白N末端含有四个半胱氨酸，前三个的排布为Cys-Gly-Asn-Cys-Asp-Cys，第四个不是以成对的半胱氨酸出现，而是高度保守序列Gln-Cys-Xaa-Lys-Lys-Gly中的一部分，C末端半胱氨酸以Cys-xaa-Cys基团出现，与MT-1和MT-2相似，两个结构域之间以近40个氨基酸分隔开。
4.MT-4:
具有三个半氨胱酸富集区，每个区有5一6个半胱氨酸，之间由10-15个氨基酸连接，大多数半胱氨酸以Cys-Xaa-Cys基团出现，尽管还有大量的MT-4没有被证实，与那些单子叶植物相比，来自双子叶植物的MT-4在N末端第一个半胱氨酸之前多出8-10个氨基酸。
MT-4与植物鳌和素结构相似。
具有这四种类型MT的植物目前发现的只有拟南芥、番茄和甘蔗[20]。
1.2.5植物金属硫蛋白的应用前景
MT具有广泛的应用前景和巨大的市场潜力。
在生物学方面，MT可作为生物学标志物在疾病检测和环保检测中发挥作用;利用MT基因的高度可诱导性，通过MT启动子建立一系列外源基因高效表达系统；利用MT可回收金属和清除土壤中重金属污染。
由于MT有强的清除自由基能力，用MT生产的化妆品将会比SOD具有更好的美容效果及抗辐射作用[21]。
同时用MT生产的药物或保健品将会非常有效地增强机体的应激反应和抵抗力，为心血管疾病、糖尿病的治疗提供一种新的途径。
在肿瘤预防和治疗中，MT可抵抗重金属和烷化剂的致癌、致突变作用。
随着人们对MT研究的深入，用MT治疗肿瘤有望成为一种有效手段。
总之，植物MT具有很大的开发潜力和无法估量的价值，随着人们对植物MT研究的不断深入，植物MT的应用也会越来越广泛[22]。
2实验材料与方法
2.1实验仪器、材料和试剂
2.1.1实验仪器
琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、制胶槽、梳子、DYY-11型电泳仪，北京六一仪器厂）
SW-CJ-1B型单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）
容声BD/C-310冰柜
海尔BCD-226冰箱
PL203电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）
SC-329GB海尔冷柜
隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）
WD-9403紫外仪（北京六一仪器厂）
ZHWY-200B恒温培养振荡器（上海智城分析仪器有限公司）
XW-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司）
9700型DNA扩增仪（基因有限公司）
Pico17多用途台式高速离心机
DK-8D电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）
SIM-140L制冰机（SANYOElectricCo.Ltd）
RODI反渗透去离子纯水机
78-1强力加热搅拌器（金坛市医疗仪器厂）
PH600酸度计
SX500高压蒸汽灭菌锅
微量移液器（2.5µl、10µl、20µl、200µl、1000µl）
上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒
2.1.2实验材料
pMD18-TSimplevector购自大连宝生物公司；PGEX4T-1vector,大肠杆菌（E.coli）DH5α、BL21均为实验室保存
2.1.3试剂
（1）Trizol试剂
异硫氰酸胍
苯酚
（2）50×浓缩的TAE缓冲液（1L）
Tris242g
EDTA57.1ml
0.5mol/L冰醋酸100ml
（3）LB液体培养基（1L/组）
胰蛋白胨10g
酵母提取物5g
NaCl10g
加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。
LB固体培养基在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g
（4）质粒提取溶液Ⅰ（SolutionⅠ）
50mmol/L葡萄糖
25mmol/LTris-Cl（pH8.0）
10mmol/LEDTA（pH8.0）
高压灭菌后，4℃保存备用。
（5）质粒提取溶液Ⅱ（SolutionⅡ）
0.2mol/LNaOH
1%SDS
现用现配，NaOH与SDS的比例为1:
1
（6）质粒提取溶液Ⅲ（100ml）（SolutionⅢ）
5mol/L醋酸钾60ml
冰醋酸11.5ml
水28.5ml
配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。
（7）氨苄青霉素（Amp）50mg/ml，置-20℃冰箱保存备用
（8）卡那霉素（Kana）50mg/ml，置-20℃冰箱保存备用
（9）利福霉素（Rif）50mg/ml，置-20℃冰箱保存备用
（10）溴化乙锭溶液（10mg/ml,室温，棕色瓶保存）
溴化乙锭1.0g
三蒸水100ml
（11）酶类：
限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ；T4连接酶；Taq酶
（12）其它试剂：
琼脂糖、异丙醇、70%乙醇、氯仿、10×loadingbuffer
（13）原核表达序列克隆引物
原核-BXC-Contig82-MT2-F（withBamHI）
ggatccATGTCTTGCTGTGGTGG
原核-BXC-Contig82-MT2-R（withEcoRI）
gaattcGCAGGTGCAGGGGTT
原核-BXC-Contig42-MT3-F（withBamHI）
ggatccATGGACTGTGGAAACT
原核-BXC-Contig42-MT3EcoRI--pGEX4T1
gaattcGCCGCAAGTGCAGGTG
原核-BXC-Contig16-MT2-F（withBamHI）
ggatccATGTCTTGTTGTGGCGGA
原核-BXC-Contig16-MT3EcoRI--pGEX4T1
gaattcACCGCAAGTGCAGGGGTTG
2.2实验步骤
2.2.1植物材料的处理
用0.3mol/L浓度的NaCl盐溶液处理温室中栽培的补血草24h以上，诱导耐盐相关基因高度表达，然后取补血草健康叶片用双蒸水清洗，吸水纸吸干残留水分，用锡纸包裹于-80℃冰箱保存。
2.2.2补血草总RNA的提取
1.称取1-1.5g预处理的补血草叶片，在预冷的灭菌干燥研钵中加入液氮研磨成粉末移入DEPC处理并灭菌的1.5mlEppendorf离心管
2.加入1mlTrizol试剂，充分混匀。
3.15～30℃，5min。
4.4℃，13000rpm,10min。
5.取上清，加入氯仿200µl，混匀，15～30℃，放置2～5min。
6.4℃，12000rpm,10min。
7.取上清移至另一1.5mlEppendorf离心管，加预冷的异丙醇500µl，15～30℃，10min
8.4℃，12000rpm,10min
9.弃上清，加1ml75%乙醇（用DEPC水配制），漩涡器上加一张滤纸涡匀。
10.4℃，9000rpm,5min。
11.弃上清，用灭菌枪头超净台吸干，超净台上风吹干5～10min.
12.用不含RNase的水（DEPC水）溶解RNA（用枪头反复吸打）
13.55~65℃，水浴10min（破坏二级结构）
14.-20℃，可以暂存，然后做反转录。
补血草总RNA提取结果见图1。
2.2.3反转录
通过反转录PCR获得模板cDNA.
按下列反应组成配制反转录反应液
RNA2ul
10uLoligdT1ul
水（含DEPC）7ul
↓
72℃水浴3分钟
↓
5×buffer4ul
10uldNTP4ul
RNaseinhabitor1ul
M-MLV1ul
（在冰上加）
将以上体系混匀（枪头反复吹打），42℃水浴90分钟。
得到cDNA。
2.2.4PCR扩增目的基因
1.按以下组成配制反应体系
模板1ul
正向引物F1ul
反向引物R1ul
25ul10×buffer2.5ul
dNTP1ul
KODplus0.25ul
MgSO42ul
H2O18.2ul
2.PCR扩增目的片段
预变性94℃5min
变性94℃30s
退火55℃30s35cycles
延伸72℃1min
充分延伸72℃10min
保存4℃∞
3.电泳检测
3.1用电子天平称取0.2g琼脂糖，放于一锥形瓶中，加入20ml电极缓冲液（TAE），加热使之两次沸腾，使琼脂糖充分溶解。
3.2准备好电泳槽并放好梳子（小齿的），待锥形瓶冷却到不烫手时，用移液枪的的枪头蘸一下棕色瓶中的EB，枪头深入液面下0.5cm为宜，将枪头放入锥形瓶液体中，混匀，用枪头引流倒入电泳槽，静置20min。
3.3等胶凝固，缓慢拔下梳子。
3.4取5ulPCR反应产物与微量10×Loadingbufffer混匀及Marker,点进样品孔中。
3.5进行120v稳压电泳，待指示剂走到胶的一半时，停止电泳。
3.6将胶放在紫外仪中，与标准的Marker条带进行比较，确定扩增片段的大小，确定是否扩增成功。
3.7200bp左右的条带就是为所需要的目的条带。
4.加尾:
向PCR产物中加入0.5ul的普通Taq酶，混匀，在PCR仪中72℃，反应20分钟。
形成粘性末端。
PCR产物分析见图片2。
2.2.5目的片段连接到pMD18-T载体上
按以下组成配制连接体系
SolutionⅠ2.5ul
5ulpMDT18-vector0.25ul
PCR产物1.5ul
H2O0.75ul
14-16℃接连过夜。
2.2.6大肠杆菌超级感受态细胞的制备
⒈在LB固体培养基上划线（用-80℃冻存的DH5α的菌种），37℃倒置培养过夜，至产生单菌落。
⒉挑取一个单菌落，接种于250ml锥形瓶的25mlSOB液体培养基中,37℃（250-300r/min）培养6-8h。
⒊晚上约6点钟，将上述培养物接种于3个盛有250mlSOB液体培养基的1L三角瓶中，第一个加10ml，第二个加4ml，第三个加2ml，于18-22℃中速摇床过夜。
至有一瓶OD600约为0.55，将培养瓶置于冰上10min,弃去另两瓶培养物。
⒋4℃，2500g离心10min收集菌体（50ml离心管）。
⒌倒去培养液，向离心管中加入16ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀（冰上轻晃）。
⒍4℃，2500g离心10min收集菌体，倒去上清，加入4mlInoue转化缓冲液轻轻重悬（可用枪头轻轻吹打）。
⒎加入300ulDMSO0轻轻混匀细菌悬液，放置冰上10min。
⒏迅速分装于1.5ml的EP管中，每管100ul。
⒐用液氮速冻后存于-80℃冰箱中备用。
⒑取一个纯化了的质粒转入制备好的超级感受态细胞中检测感受态的转化效率。
2.2.7连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
⒈取连接产物加到分装的100ul的感受态细胞中混匀，冰浴30min。
⒉42℃热激90s，迅速在冰浴中冷却3-5min。
⒊上述管中加入600-800ulLB液体培养基，于37℃160-180r/min振荡培养（Ep管竖直放置）45min-1h。
⒋菌液低速离心8000rpm离心1min，倒掉部分上清液，保留约200ul,重悬菌液。
⒌取适量（100ul）菌液涂布LB平板（含Amp50ug/ml）,室温涂布均匀后（至菌液完全被吸干），于37℃倒置培养过夜。
⒍第二天取出长有单菌落的平板放在4℃冰箱中，下午挑菌（约5点半左右）。
2.2.8碱裂解法提取质粒
⒈挑菌
取过夜培养的平板，在超净工作台内，用灭菌的牙签挑取10个单菌落放入3mlLB液体培养基（含Amp50ug/ml）中,用灭菌的试管塞封闭试管口，37℃180r/min振荡培养过夜。
⒉提质粒
⑴将过夜培养的菌液（每次按﹤1.5ml菌液）倒入1.5ml的Eppendorf中，10,000rpm离心1min，去掉上清液，重复此过程，收集菌体两次，沉淀悬于160ul溶液Ⅰ（-4℃保存）中，在涡旋器上使菌体充分悬浮。
⑵加入320ul溶液Ⅱ（现用现配），混匀至澄清，静置5min。
⑶加入240ul溶液Ⅲ（-4℃保存）混匀，有絮状沉
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