版中国药典微生物限度检查方式验证方案.docx
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版中国药典微生物限度检查方式验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方式验证方案
起草
部门:
QC组
签名:
日期:
审核
部门:
QC组
签名:
日期:
部门:
质量部
签名:
日期:
批准
质量负责人
签名:
日期:
质量部
颁发
本文件根据需要应分发于以下部门:
01质量部
下表用于记录修订/变更要紧内容及历史。
文件编号
修订原因
修订日期
TS-VP-4201-00
按GMP(2010年修订版)要求新制定
1.概述
2.验证目的和范围
3.组织及职责
4.验证进度打算表
5.验证所需要的仪器设备及相关文件的确认
6.验证所需要的菌种、培育基、查验样品的确认
7.验证项目和验证方式
实验菌株
需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方式验证的菌液制备
需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方式验证--常规倾注平皿法
需氧菌总数检查方式验证—离心沉淀-薄膜过滤法
操纵菌检查方式验证—离心沉淀-薄膜过滤法
8.误差与漏项操纵
9.验证报告会审
1.概述
我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊,产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、和大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105:
微生物计数法,和1106:
操纵菌检查法的规定,本公司对该产品的微生物限度检查方式予以验证。
通过验证以确认所采纳的微生物限度检查方式适用。
人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄和常常利用辅料成份,文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性,对霉菌和酵母菌无抑菌活性。
甲硝唑在水中微溶,能够通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的阻碍。
本验证方案通过实验菌株的回收率测试,第一确认常规倾注平皿法是不是适用于本品的微生物限度检查;如常规倾注平皿法不适用,那么进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是不是适用于本品的微生物限度检查。
本验证方案依照样品特性制定微生物限度检查方式和查验条件,按制定的方式进行实验,依照验证结果判定是不是符合验证标准。
2.验证目的和范围
验证该产品的微生物限度检查方式的适用性,对其有效性进行评判,保证查验结果的靠得住性。
本验证方案采纳3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊,进行微生物限度检查方式的验证。
3.组织及职责
验证方案和验证报告的起草、审核、批准
验证方案由质量部QC组负责起草,由质量部审核,最终由质量负责人批准。
验证方案实施完成后,由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告,由质量部审核,最终由质量负责人批准报告。
验证方案的培训
验证方案在经质量负责人批准后,,由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作,并将该次的培训记录归档。
验证方案实施进程中的变更和误差
验证方案实施进程中如有变更和误差,质量负责人应当组织进行评估并采取相应的操纵方法。
验证工作小组成员表
姓名
部门及职务
职责
黄汉新
质量负责人/质量受权人
负责验证方案及报告的批准
胡建新
质量部QA组长
审核验证方案、审核验证报告并协调工作
曾凤敏
质量部QC组长
负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作
刘红华
质量部QC
负责验证方案起草、具体实施、报告工作
4.验证进度打算表
本次微生物限度检查方式验证的打算安排时刻是2021年12月至2016年1月。
5.验证所需要的仪器设备及相关文件的确认
.要紧查验仪器设备确认表
序号
仪器设备名称
型号
编号
校准单位
校准日期
有效期至
1
电子天平
2
生化培养箱
3
生化培养箱
4
生化培养箱
5
立式压力蒸汽灭菌锅
6
生物洁净安全柜
检查人/日期:
复核人/日期:
.验证所需文件的确认表
文件名称
文件编码
是否有效版本
文件保存处
《人工牛黄甲硝唑胶囊内控质量标准》
□是□否
质量部
《人工牛黄甲硝唑胶囊检验操作规程》
□是□否
质量部
《取样操作规程》
□是□否
质量部
《微生物限度检查操作规程》
□是□否
质量部
《微生物实验室清洁消毒操作规程》
□是□否
质量部
《培养基的管理制度》
□是□否
质量部
《检定菌的保存、传代、使用、销毁规程》
□是□否
质量部
《LDZX-30FBS立式压力压蒸汽灭菌器操作规程》
□是□否
质量部
《SPX-150B生化培养箱操作规程》
□是□否
质量部
《BHC-1300IIA/B3生物洁净安全柜操作规程》
□是□否
质量部
《JJ200电子天平操作规程》
□是□否
质量部
检查人/日期:
复核人/日期:
6.验证所需要的菌种、培育基、查验样品的确认
.实验菌种检查表
序号
菌种名称
代码
冻干菌种
批号
来源
1
金黄色葡萄球菌
CMCC(B)26003
中国食品药品检定研究院
2
铜绿假单胞菌
CMCC(B)10104
中国食品药品检定研究院
3
枯草芽孢杆菌
CMCC(B)63501
中国食品药品检定研究院
4
白色念珠菌
CMCC(F)98001
中国食品药品检定研究院
5
黑曲霉
CMCC(F)98003
中国食品药品检定研究院
6
大肠埃希菌
CMCC(B)44102
中国食品药品检定研究院
7
乙型副伤寒沙门菌
CMCC(B)50094
中国食品药品检定研究院
检查人/日期:
复核人/日期:
实验所需的培育基检查
序号
名称
生产厂家
是否通过培养基适用性试验
批号
01
胰酪大豆胨液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
02
胰酪大豆胨琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
03
沙氏葡萄糖液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
04
沙氏葡萄糖琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
05
麦康凯液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
06
麦康凯琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
07
RV沙门菌增菌液体培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
08
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
09
三糖铁琼脂培养基
北京三药科技开发公司
□是□否
检查人/日期:
复核人/日期:
.查验样品确认表
序号
品名
生产厂家
批号
规格
是否按GMP要求生产
1
人工牛黄甲硝唑胶囊
佛山市华普生药业有限公司
甲硝唑
人工牛黄5mg
□是□否
2
人工牛黄甲硝唑胶囊
佛山市华普生药业有限公司
甲硝唑
人工牛黄5mg
□是□否
3
人工牛黄甲硝唑胶囊
佛山市华普生药业有限公司
甲硝唑
人工牛黄5mg
□是□否
检查人/日期:
复核人/日期:
7.验证项目和验证方式
实验菌株
人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方式验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉;操纵菌检查方式验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。
实验菌株的传代次数不得超过5代,并采纳适宜的菌种保藏技术进行保留,以保证明验菌株的生物学特性。
需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方式验证的菌液制备
别离接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培育物至10ml胰酪大豆胨液体培育基中,30~35℃培育18~24小时,取此培育液1ml加%无菌氯化钠溶液9ml,采纳10倍递增稀释法,稀释至10-5~10-7,制成50~100cfu/ml的菌悬液备用。
接种白色念珠菌的新鲜培育物至10ml沙氏葡萄糖液体培育基中,20~25℃培育2~3天,取此培育液1ml加%无菌氯化钠溶液9ml,采纳10倍递增稀释法,稀释至10-5~10-7,制成50~100cfu/ml的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培育物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上,20~25℃培育5~7天,直到取得丰硕的孢子。
加入3~5ml含有%聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,吸至无菌试管中,取1ml加含有%聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液9ml,采纳10倍递增稀释法,稀释至10-5~10-7,制成50~100cfu/m的孢子悬液备用。
菌液制备后假设在室温下放置,应在2小时内利用;假设保留在2~8℃,可在24小时内利用。
黑曲霉孢子悬液可保留在2~8℃,在验证过的贮存期内利用。
验证时,对各实验菌的回收率一一进行验证。
.需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方式验证--常规倾注平皿法
供试液的制备
取供试品10g,加%无菌氯化钠溶液至100ml,振摇,制成1:
10的供试液。
实验组
取1:
10的供试液1ml和项下制备的50~100cfu的实验菌,别离注入平皿中,当即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀,每株实验菌株平行制备2个平皿。
置30~35℃培育箱中培育3天(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌),或培育5天(白色念珠菌、黑曲霉),点计菌落数。
另取1:
10的供试液1ml和项下制备的50~100cfu的白色念珠菌、黑曲霉,别离注入平皿中,当即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基20ml混匀,每株实验菌株平行制备2个平皿。
置20~25℃培育箱中培育5天,点计菌落数。
供试品对照组
取1:
10的供试液1ml注入平皿中,当即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀,平行制备2个平皿。
置30~35℃培育箱中培育5天,点计菌落数。
另取1:
10的供试液1ml注入平皿中,当即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基培育基20ml混匀,平行制备2个平皿。
置20~25℃培育箱中培育5天,点计菌落数。
菌液对照组
取%无菌氯化钠溶液1ml和项下制备的50~100cfu的实验菌,别离注入平皿中,当即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培育基20ml混匀,每株实验菌株平行制备2个平皿。
置30~35℃培育箱中培育3天(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌),或培育5天(白色念珠菌、黑曲霉),点计菌落数。
另取%无菌氯化钠溶液1ml和项下制备的50~100cfu的白色念珠菌、黑曲霉,别离注入平皿中,当即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培育基培育基20ml混匀,每株实验菌株平行制备2个平皿。
置20~25℃培育箱中培育5天,点计菌落数。
常规倾注平皿法方式验证的同意标准
实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即实验菌的回收率)应在0.5〜2范围内。
常规倾注平皿法方式验证的结果
常规倾注平皿法测定需氧菌总数方式验证结果
实验次数1:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
实验次数2:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
实验次数3:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方式验证结果
实验次数1:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;沙氏葡萄糖琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
实验次数2:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;沙氏葡萄糖琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
实验次数3:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;沙氏葡萄糖琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
试验菌的回收率
1
2
均值
1
2
均值
1
2
均值
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方式验证小结
依照验证方案的要求进行实验,假设各实验菌株的回收率在~2范围内,那么可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。
如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查,但不适用于
需氧菌总数检查,那么下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是不是适用于本品的需氧菌总数检查。
.需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法
供试液的制备
取供试品10g,加%无菌氯化钠溶液至100ml,振摇,制成1:
10的供试液贮备液。
取1:
10的供试液贮备液50ml,经500转/分钟离心3分钟,取上清液得供试液。
实验组
取供试液1ml,加至100ml%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜(孔径μm混合纤维素膜)后,以%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次(100ml/次),然后在第3次冲洗液(%无菌氯化钠溶液)中加入项下制备的50~100cfu的实验菌,过滤。
每株实验菌株平行制备2张滤膜。
掏出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上,30~35℃倒置培育3天(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌),或培育5天(白色念珠菌、黑曲霉),点计菌落数。
供试品对照组
取供试液1ml,加至100ml%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜(孔径μm混合纤维素膜)后,以%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次(100ml/次),平行制备2张滤膜。
掏出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上,30~35℃倒置培育5天,点计菌落数。
菌液对照组
取%无菌氯化钠溶液300ml,200ml通过薄膜(孔径μm混合纤维素膜)后,在余下的%无菌氯化钠溶液中加入项下制备的50~100cfu的实验菌,过滤。
每株实验菌株平行制备2张滤膜。
掏出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上,30~35℃倒置培育3天(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌),或培育5天(白色念珠菌、黑曲霉),点计菌落数。
稀释剂对照组
依照项下菌液制备方式,以%无菌氯化钠为稀释液,将各菌液稀释至含菌50~100cfu/ml,然后以500转/分钟离心3分钟,取上层菌液作下面的实验。
取上层菌液1ml,加至100ml%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜(孔径μm混合纤维素膜)
后,以%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次(100ml/次),每株实验菌株平行制备2张滤膜。
掏出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基平皿上,30~35℃倒置培育3天(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌),或培育5天(白色念珠菌、黑曲霉),点计菌落数。
离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方式验证的同意标准
实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即实验菌的回收率)应在0.5〜2范围内,同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0.5〜2范围内。
离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方式验证的结果
实验次数1:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
稀释剂对照组
试验组
各菌株回收率
稀释剂对照组各菌株回收率
1
2
均值
1
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
实验次数2:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
稀释剂对照组
试验组
各菌株回收率
稀释剂对照组各菌株回收率
1
2
均值
1
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
实验次数3:
人工牛黄甲硝唑胶囊批号:
;胰酪大豆胨琼脂培育基配制批号:
培育箱型号编号;培育温度:
;培育时长:
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、
枯草芽孢杆菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天
试验菌株
菌种代数
试验组
供试品对照组
菌液对照组
稀释剂对照组
试验组
各菌株回收率
稀释剂对照组各菌株回收率
1
2
均值
1
1
2
均值
1
2
均值
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
实验人/日期:
复核人/日期:
离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方式验证小结
依照验证方案的要求进行实验,假设实验组各实验菌株的回收率在~2范围内,稀释剂对照组各实验菌株的的回收率也在~2范围内,那么可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查。
人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方式及计数方式进行需氧菌总数计数。
.操纵菌检查方式验证—离心沉淀-薄膜过滤法
假设在需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方式验证--常规倾注平皿法的实验中,证明了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性,不能利用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查,那么为了确保操纵菌检查的靠得住性,采纳可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行操纵菌检查,依照以下方案进行方式学验证。
实验菌株
人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的操纵菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌,因此选择这两种菌株进行操纵菌检查的方式学验证。
实验菌株的传代次数不得超过5代,并采纳适宜的菌种保藏技术进行保留,以保证明验菌株的生物学特性。
操纵菌检查方式验证的菌液制备
别离接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培育物至10ml胰酪大豆胨液体培育基中,30~35℃培育18~24小时,取此培育液1ml加%无菌氯化钠溶液9ml,采纳10倍递增稀释法,稀释至10-5~10-7,制成50~100cfu/ml的菌悬液备用。
菌液制备后假设在室温下放置,应在2小时内利用;假设保留在2~8℃,可在24小时内利用。
验证时,对各实验菌的回收率一一进行验证。
大肠埃希菌检查方式验证
供试液的制备
取供试品10g,加%无菌氯化钠溶液至100ml,振摇,制成1:
10的供试液贮备液。
取1:
10的供试液贮备液50ml,经500转/分钟离心4分钟,取上清液得供试液。
实验组
取供试液10ml,加至100%无菌氯化钠溶液中,混匀,全量通过薄膜后,以%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次(