食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析.docx

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食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析

食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析

杨广锐

【摘要】蜡样芽孢杆菌分布广泛，是常见的食品污染菌和条件致病菌，通过产生呕吐毒素和腹泻毒素导致食物中毒。

对常规检测方法、酶反应检测方法、PCR技术和免疫学技术检测方法进行归类分析，总结各种检测方法的优点和局限性。

【期刊名称】《食品安全导刊》

【年（卷）,期】2014（000）026

【总页数】3页（P63-65）

【关键词】蜡样芽孢杆菌;检测;局限性

【作者】杨广锐

【作者单位】石河子大学食品学院

【正文语种】中文

【中图分类】医药卫生

Nov2014CHINAFOODSAFETY63分析与检测蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）是芽孢杆菌属（Bacillus）中的一种革兰氏阳性杆菌，菌体大小为（1.0μm~1.2μm）×（3μm~5μm），杆状菌体有成链的趋势，芽孢呈椭圆形，中生，孢子囊不明显膨胀。

蜡样芽孢杆菌能够发酵葡萄糖产酸，不发酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇，可将硝酸盐还原，过氧化氢酶试验阳性，能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶。

最高生长温度35℃~45℃，最低生长温度10℃~20℃，能够在7%NaCl中生长，生长在葡萄糖洋菜上的细胞含有复红不着色的小球，不产生细胞内蛋白晶体[1]。

目前，国内外对于蜡样芽孢杆菌的检测方法，主要有常规检测方法、酶反应检测方法、PCR技术和免疫学技术检测方法等。

1 常规检测方法常规的检测方法一般分为平板计数法和MPN计数法，检测步骤都包括分离培养、纯化培养、证实试验等过程。

在证实试验中，有革兰氏染色、葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、改良V-P试验、L-酪氨酸分解试验、溶菌酶试验、动力试验、溶血试验、蛋白毒素结晶试验等[6-7]。

常规检测方法的优点是技术成熟、容易操作，国家标准和行业标准中的检验方法都是微生物实验室中常见的基础操作，具有一般微生物检测基础的人员都可以完成检测。

同时，常规检测方法也存在以下缺点：

①常规检测方法中使用的甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）培养基，在配置时需要使用鸡蛋制作50%卵黄液加入基础培养基中，以无菌操作取出卵黄的过程比较麻烦，且容易污染影响检验结果[7]。

另外，利用卵磷脂酶分解培养基中的卵黄产生过大的沉淀带，导致菌落之间会漫延连接而难以计数的缺点，给食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析杨广锐石河子大学食品学院摘　要：

蜡样芽孢杆菌分布广泛，是常见的食品污染菌和条件致病菌，通过产生呕吐毒素和腹泻毒素导致食物中毒。

对常规检测方法、酶反应检测方法、PCR技术和免疫学技术检测方法进行归类分析，总结各种检测方法的优点和局限性。

关键词：

蜡样芽孢杆菌；检测；局限性Nov2014CHINAFOODSAFETY63蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）是芽孢杆菌属（Bacillus）中的一种革兰氏阳性杆菌，菌体大小为（1.0μm~1.2μm）×（3μm~5μm），杆状菌体有成链的趋势，芽孢呈椭圆形，中生，孢子囊不明显膨胀。

蜡样芽孢杆菌能够发酵葡萄糖产酸，不发酵阿拉伯糖、木糖和甘露醇，可将硝酸盐还原，过氧化氢酶试验阳性，能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶。

最高生长温度35℃~45℃，最低生长温度10℃~20℃，能够在7%NaCl中生长，生长在葡萄糖洋菜上的细胞含有复红不着色的小球，不产生细胞内蛋白晶体[1]。

目前，国内外对于蜡样芽孢杆菌的检测方法，主要有常规检测方法、酶反应检测方法、PCR技术和免疫学技术检测方法等。

常规的检测方法一般分为平板计数法和MPN计数法，检测步骤都包括分离培养、纯化培养、证实试验等过程。

在证实试验中，有革兰氏染色、葡萄糖发酵试验、硝酸盐还原试验、改良V-P试验、L-酪氨酸分解试验、溶菌酶试验、动力试验、溶血试验、蛋白毒素结晶试验等[6-7]。

常规检测方法的优点是技术成熟、容易操作，国家标准和行业标准中的检验方法都是微生物实验室中常见的基础操作，具有一般微生物检测基础的人员都可以完成检测。

同时，常规检测方法也存在以下缺点：

①常规检测方法中使用的甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）培养基，在配置时需要使用鸡蛋制作50%卵黄液加入基础培养基中，以无菌操作取出卵黄的过程比较麻烦，且容易污染影响检验结果[7]。

另外，利用卵磷脂酶分解培养基中的卵黄产生过大的沉淀带，导致菌落之间会漫延连接而难以计数的缺点，给杨广锐石河子大学食品学院摘　要：

蜡样芽孢杆菌分布广泛，是常见的食品污染菌和条件致病菌，通过产生呕吐毒素和腹泻毒素导致食物中毒。

对常规检测方法、酶反应检测方法、PCR技术和免疫学技术检测方法进行归类分析，总结各种检测方法的优点和局限性。

关键词：

蜡样芽孢杆菌；检测；局限性64食品安全导刊2014年11月Technology科技分析与检测检测结果带来极大的不确定性[8]。

②常规检验方法需要经过分离培养、纯化培养、证实试验等步骤，其中每个步骤的检验时间都在24h~48h，个别试验甚至需要72h才能完成，这样最终检验完毕至少需要耗时4d~6d，费时费力，极大限制了在食品加工中对蜡样芽孢杆菌污染的有效监控。

③在SN/T方法中，规定可以使用API50CHB生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统，或者其他等效产品用作可替代的生化实验，此类产品可以有效的降低检测人员的劳动强度，给检测工作提供了很大的方便，但同时带来的检测成本上升也是国内一般中小型食品企业所难以承受的，因此限制了此类产品的广泛应用。

2 酶反应检测方法酶反应检测方法在蜡样芽孢杆菌检测中的应用，最突出的就是显色培养基技术。

卢勉飞等对一种蜡样芽孢杆菌显色培养基（HKMCB）与国外OXOID蜡样芽孢杆菌显色培养基（OXCB）以及传统甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基（MYP）进行了比较和初步评价，结果显示利用显色培养基检测蜡样芽孢杆菌，较传统平板具有较高的特异性和选择性[8]。

张淑红等设计蜡样芽孢杆菌显色培养基（HKCB）后，进行人工污染样品和实际样品检验，结果显示在人工污染样品和实际样品检测中，显色培养基（HKCB）与传统平板（MYP）可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有较高的特异性[9]。

从对蜡样芽孢杆菌显色培养基的研究中可以看出，酶反应检测方法的优点在于通过直接观察菌落颜色即可对菌种做出初步鉴定，具有快速、简便和经济的特点，为蜡样芽孢杆菌快速检测构建了一个技术平台。

酶反应检测方法的不足在于：

①虽然商品化的显色培养基已被许多国家的政府和检测机构采用，但我国的食品卫生标准中，尚未规定可以使用显色培养基用于蜡样芽孢杆菌的检测，这就导致了显色培养基暂时难以广泛应用于食品中蜡样芽孢杆菌的检测。

②蜡样芽孢杆菌与同为芽孢杆菌属的苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）、蕈状芽孢杆菌（B.mycoides）的形态特征、生理生化特征非常相似，并有着极高的DNA同源性。

例如炭疽芽孢杆菌Sterne株与蜡样芽孢杆菌模式株NCDO1771的16SrRNA序列相似度达100%，16SrRNA-23SrRNA基因间隔序列仅有2个核苷酸的差异[10]，而对于苏云金芽孢杆菌，目前还没有任何一个生化反应可以把它与蜡样芽孢杆菌相区分，两者表型上的区别仅仅在于能否在芽孢形成时产生位于芽孢膜外的伴胞晶体，需用显微镜观察。

因此仅使用显色培养基检测，仍然未能最终实现蜡样芽孢杆菌的快速简便检测。

3 PCR技术和免疫学技术检测方法利用PCR技术、免疫学技术进行蜡样芽孢杆菌的检测，国内外已经进行了广泛的研究。

通过PCR扩增致病性蜡样芽孢杆菌的特定基因，可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测[11]。

在常规PCR基础上，建立和发展了扩增片段长度多态性（AFLP）技术[12]、过滤富集菌体PCR技术[13]、实时荧光PCR技术[14]、环介导等温扩增（LAMP）技术[15]等用于蜡样芽孢杆菌的快速检测；利用反向被动乳胶凝集试验（RPLA）、蛋白印记技术（ColonyBlot64食品安全导刊2014年11月Technology科技检测结果带来极大的不确定性[8]。

②常规检验方法需要经过分离培养、纯化培养、证实试验等步骤，其中每个步骤的检验时间都在24h~48h，个别试验甚至需要72h才能完成，这样最终检验完毕至少需要耗时4d~6d，费时费力，极大限制了在食品加工中对蜡样芽孢杆菌污染的有效监控。

③在SN/T方法中，规定可以使用API50CHB生化鉴定试剂盒或VITEK全自动微生物鉴定系统，或者其他等效产品用作可替代的生化实验，此类产品可以有效的降低检测人员的劳动强度，给检测工作提供了很大的方便，但同时带来的检测成本上升也是国内一般中小型食品企业所难以承受的，因此限制了此类产品的广泛应用。

酶反应检测方法在蜡样芽孢杆菌检测中的应用，最突出的就是显色培养基技术。

卢勉飞等对一种蜡样芽孢杆菌显色培养基（HKMCB）与国外OXOID蜡样芽孢杆菌显色培养基（OXCB）以及传统甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基（MYP）进行了比较和初步评价，结果显示利用显色培养基检测蜡样芽孢杆菌，较传统平板具有较高的特异性和选择性[8]。

张淑红等设计蜡样芽孢杆菌显色培养基（HKCB）后，进行人工污染样品和实际样品检验，结果显示在人工污染样品和实际样品检测中，显色培养基（HKCB）与传统平板（MYP）可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有较高的特异性[9]。

从对蜡样芽孢杆菌显色培养基的研究中可以看出，酶反应检测方法的优点在于通过直接观察菌落颜色即可对菌种做出初步鉴定，具有快速、简便和经济的特点，为蜡样芽孢杆菌快速检测构建了一个技术平台。

酶反应检测方法的不足在于：

①虽然商品化的显色培养基已被许多国家的政府和检测机构采用，但我国的食品卫生标准中，尚未规定可以使用显色培养基用于蜡样芽孢杆菌的检测，这就导致了显色培养基暂时难以广泛应用于食品中蜡样芽孢杆菌的检测。

②蜡样芽孢杆菌与同为芽孢杆菌属的苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）、蕈状芽孢杆菌（B.mycoides）的形态特征、生理生化特征非常相似，并有着极高的DNA同源性。

例如炭疽芽孢杆菌Sterne株与蜡样芽孢杆菌模式株NCDO1771的16SrRNA序列相似度达100%，16SrRNA-23SrRNA基因间隔序列仅有2个核苷酸的差异[10]，而对于苏云金芽孢杆菌，目前还没有任何一个生化反应可以把它与蜡样芽孢杆菌相区分，两者表型上的区别仅仅在于能否在芽孢形成时产生位于芽孢膜外的伴胞晶体，需用显微镜观察。

因此仅使用显色培养基检测，仍然未能最终实现蜡样芽孢杆菌的快速简便检测。

利用PCR技术、免疫学技术进行蜡样芽孢杆菌的检测，国内外已经进行了广泛的研究。

通过PCR扩增致病性蜡样芽孢杆菌的特定基因，可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测[11]。

在常规PCR基础上，建立和发展了扩增片段长度多态性（AFLP）技术[12]、过滤富集菌体PCR技术[13]、实时荧光PCR技术[14]、环介导等温扩增（LAMP）技术[15]等用于蜡样芽孢杆菌的快速检测；利用反向被动乳胶凝集试验（RPLA）、蛋白印记技术（ColonyBlotNov2014CHINAFOODSAFETY65ImmunoassayCBI）快速检测蜡样芽孢杆菌的方法均有报道[16]。

将分子生物学、免疫学的技术应用于蜡样芽孢杆菌的检测，建立了方便、快捷的技术方法，整个检测过程只需6h左右即可完成[13]，甚至可以在2h内完成[15]，大幅度缩短了检测时间，降低了成本，同时PCR技术、免疫学技术检测方法还具有灵敏度高、特异性强、实验条件简单的优点，易于推广应用。

此类检测技术的缺点在于：

①对检测人员的技术水平要求较高，需熟练掌握分子生物学等相关技术，并且检测结果的稳定性和重现性相对较低，技术还不够成熟，目前暂不适合于通过国家标准等向相关企业和检测机构推广。

②PCR技术的应用，是针对致病性蜡样芽孢杆菌致病相关基因序列设计特异引物，一般基于entFM[13]、cereolysinAB[14]、hblA[17]、bceT[17]等具有毒力的特异性保守基因，杨媛等从原料乳中检出蜡样芽孢杆菌33株，其中27株获得了hblA基因引物扩增片段，24株获得了bceT基因引物扩增片段，同时含有两段基因的有20株，而两种毒性基因都不含有的有2株[17]，李煜等在17株蜡样芽孢杆菌中发现其中有1株无溶血活性[18]，胡晓敏等报道在1株蜡样芽孢杆菌无溶血活性，基因检测发现无肠毒素基因[19]。

由此可见，利用PCR技术检测蜡样芽孢杆菌，仅能检测到与特异引物相关的致病性菌株，与特定引物不相关的致病性菌株及不含毒力基因的非致病性菌株则不能被检测到，这也是PCR技术检测的局限性。

4 结语对食品中蜡样芽孢杆菌的检测方法进行了归类分析，可以看出每一类方法都存在固有的优点和不足，针对现行国家标准中蜡样芽孢杆菌检测方法费时费力、劳动强度大、检验成本高的特点，提出以下两方面的思考。

第一，参照ISO中假定蜡样芽孢杆菌的技术方法[20]，实现检测标准与国际接轨，只要在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）平板上出现粉红色、周围有白色沉淀环的典型菌落且该菌落在血平板上出现溶血现象的就可以确定是阳性菌，这样的检测方法既可以省略现行国标中繁琐的证实试验，降低劳动强度，缩短检验周期，又可以保证检测结果与国外检测结果的一致性，满足食品进入国际市场的需要，同时还可以提高市场准入门槛，促进国内食品生产企业提高技术水平，最终保障食品安全。

第二，加强酶反应、PCR技术和免疫学技术等快速检测方法的研究，建立一套成熟、简便、可靠的检验方法，在需要对蜡样芽孢杆菌进行鉴定到种的情况下，实现蜡样芽孢杆菌的快速检测。

参考文献：

[1]R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].北京:

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中国科学院武汉病毒研究所博士论文,2008.[4]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程（3版）[M].南京:

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将分子生物学、免疫学的技术应用于蜡样芽孢杆菌的检测，建立了方便、快捷的技术方法，整个检测过程只需6h左右即可完成[13]，甚至可以在内完成[15]，大幅度缩短了检测时间，降低了成本，同时PCR技术、免疫学技术检测方法还具有灵敏度高、特异性强、实验条件简单的优点，易于推广应用。

此类检测技术的缺点在于：

①对检测人员的技术水平要求较高，需熟练掌握分子生物学等相关技术，并且检测结果的稳定性和重现性相对较低，技术还不够成熟，目前暂不适合于通过国家标准等向相关企业和检测机构推广。

②PCR技术的应用，是针对致病性蜡样芽孢杆菌致病相关基因序列设计特异引物，一般基于entFM[13]、cereolysinAB[14]、hblA[17]、bceT[17]等具有毒力的特异性保守基因，杨媛等从原料乳中检出蜡样芽孢杆菌33株，其中27株获得了hblA基因引物扩增片段，24株获得了bceT基因引物扩增片段，同时含有两段基因的有20株，而两种毒性基因都不含有的有2株[17]，李煜等在17株蜡样芽孢杆菌中发现其中有1株无溶血活性[18]，胡晓敏等报道在1株蜡样芽孢杆菌无溶血活性，基因检测发现无肠毒素基因[19]。

由此可见，利用PCR技术检测蜡样芽孢杆菌，仅能检测到与特异引物相关的致病性菌株，与特定引物不相关的致病性菌株及不含毒力基因的非致病性菌株则不能被检测到，这也是PCR技术检测的局限性。

4 结语对食品中蜡样芽孢杆菌的检测方法进行了归类分析，可以看出每一类方法都存在固有的优点和不足，针对现行国家标准中蜡样芽孢杆菌检测方法费时费力、劳动强度大、检验成本高的特点，提出以下两方面的思考。

第一，参照ISO中假定蜡样芽孢杆菌的技术方法[20]，实现检测标准与国际接轨，只要在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）平板上出现粉红色、周围有白色沉淀环的典型菌落且该菌落在血平板上出现溶血现象的就可以确定是阳性菌，这样的检测方法既可以省略现行国标中繁琐的证实试验，降低劳动强度，缩短检验周期，又可以保证检测结果与国外检测结果的一致性，满足食品进入国际市场的需要，同时还可以提高市场准入门槛，促进国内食品生产企业提高技术水平，最终保障食品安全。

第二，加强酶反应、PCR技术和免疫学技术等快速检测方法的研究，建立一套成熟、简便、可靠的检验方法，在需要对蜡样芽孢杆菌进行鉴定到种的情况下，实现蜡样芽孢杆菌的快速检测。

[1]R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].北京:

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729-751.[2]张昕,王子军,冉陆.2008年全国突发公共卫生事件网络报告食物中毒事件分析[J].疾病监测,2010,25（5）:

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中国科学院武汉病毒研究所博士论文,2008.[4]叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程（3版）[M].南京:

东南大学出版社,2006:

798-801.[5]骆艺文,郝志凯,王印庚,等.一株引起刺参“腐皮综合征”的蜡样芽孢杆菌[J].水产科技情报,2009,36

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60-63.[6]GB/T4789.14-2003,食品卫生微生物学检验-蜡样芽胞杆菌检验[S].[7]SN/T0176-2013,出口食品中蜡样芽胞杆菌检测方法[S].[8]卢勉飞,姚华卓,腾昆仑,等.蜡样芽孢杆菌显色培养基检测效果初步评价[J].食品科技,2013,38（6）:

313-317.[9]张淑红,吴清平,张菊梅,等.应用显色培养基检测食品中蜡样芽孢杆菌的初步研究[J].现代预防医学,2009,36（4）:

622-624,634.[10]BourqueSN,ValeroJR,LavoieMC,etal.Comparativeanalysisofthe16Sto23SribosomalintergenicspacersequencesofBacillusthuringiensisstrainsandsubspeciesandofcloselyrelatedspecies[J].ApplEnvironMicrobiol,1995,61（4）:

1623-1626.[11]王振国,刘金华,肖成蕊,等.利用PCR技术检测致病性蜡样芽孢杆菌的研究[J].生物技术,2005（5）:

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492-495.[13]赵宁,吕琦,姚丽燕,等.原料乳中蜡样芽孢杆菌的快速检测[J].中国乳品工业,2009,37（9）:

43-45.[14]王振国,刘金华,徐宝梁,等.应用实时荧光PCR检测致病性蜡样芽孢杆菌[J].生物技术通讯,2006,17（