发酵工程实验讲义.docx
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发酵工程实验讲义
实验一正交实验设计法优化酵母菌的培养基
一．实验目的：
掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。
二．实验原理
生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。
由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。
三．仪器与试剂
1．仪器设备
全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电磁炉。
2．试剂
葡萄糖，蔗糖，酵母膏，KH2PO4
四．实验方法
（1）培养基的配制（见表1,2）
表1正交表试验设计
因素水平
葡萄糖
蔗糖
酵母膏
KH2PO4
1
1.0
0.0
0.5
0.5
2
2.0
1.0
1.0
1.0
3
3.0
2.0
2.0
2.0
表2正交表实验方案
编号
葡萄糖
（A）
蔗糖
（B）
酵母膏
（C）
KH2PO4
（D）
生物量（OD）
1
（1）
（1）
（1）
（1）
2
（1）
（2）
（2）
（2）
3
（1）
（3）
（3）
（3）
4
（2）
（1）
（2）
（3）
5
（2）
（2）
（3）
（1）
6
（2）
（3）
（1）
（2）
7
（3）
（1）
（3）
（2）
8
（3）
（2）
（1）
（3）
9
（3）
（3）
（2）
（1）
（2）将上述培养基配制好以后，每250ml三角瓶装入培养基100ml，于121℃下灭菌30min，冷却。
（3）冷却后接种（接种量为5％），置于28℃培养箱进行培养。
（4）测0D值：
将接种24hr后时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。
比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表2
（5）通过对正交实验所得数据进行分析,最终确定最佳培养基的组成。
五．思考题
（1）比浊计数在生产实践中有何应用价值?
（2）本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？
如果你在实验中需要测定
大肠杆菌生长的0D值，你将如何选择波长?
实验二 淀粉酶的固态发酵实验
一．实验目的
了解和掌握微生物在发酵过程中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质浓度的时间变化曲线和测定方法。
二．基本原理
淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a－1，4－葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在碱性条件下，还原糖与3、5－二硝基水杨酸共热，3、5－二硝基水杨酸被还原为3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。
查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶的活力。
三．培养基及试剂
1．培养基
培养基（250mL）：
麸皮7g，面粉0.5g，NaNO30.15g，营养盐6.5mL，pH自然。
营养盐配方（g/L）：
KH2PO43.0；（NH4）2SO42.0；Cacl20.5；MgSO4.7H2O0.5；Cocl20.003；FeSO4.7H2O0.0075；ZnSO40.002；pH5~6。
2．试剂
（1）DNS溶液的配制
酒石酸钾钠182g溶于500mL水中并加热，然后依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，2mol/L的NaOH262mL，苯酚5mL亚硫酸钠5g搅拌溶解后定容至1000mL存于棕色瓶中，放置7-10天备用。
（2）考马斯亮兰G—250溶液
称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。
（3）0.2M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）缓冲液
吸取12.3mL0.2的Na2HPO4和87.7mL0.3mol/L NaH2PO4混合均匀即得pH6.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
四．实验方法
1．淀粉酶活的测定
参照Bernfeld法。
取适当稀释的粗酶液0.5mL加到0.5mL2%可溶性淀粉液中（pH6.0，0.2mol/L磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液配制），于50℃水浴反应10min，用DNS法测定产生的还原糖。
CK
样品1
样品2
样品3
底物（mL）
0.5
0.5
0.5
0.5
酶液（mL）
0
0.5
0.5
0.5
50℃水浴准确反应10min
DNS（mL）
3
3
3
3
酶液（mL）
0.5
0
0
0
置于沸水中加热反应10min
蒸馏水
加蒸馏水至20.5mL,摇均后静置10min
550nm处测OD值
0
淀粉酶活力（IU/g干培养基）：
本实验条件下，每分钟释放出1umol还原糖所需要的酶量称为一个酶活力单位。
IU/g干培养基＝
其中：
n――稀释倍数；v――浸提比（mL/g干培养基）；
k――斜率；M――葡萄糖的分子量；
t――反应时间（10min）；1000――转换系数
2．还原糖测定
采用DNS比色法。
CK
样品1
样品2
样品3
样品（mL）
0
1
1
1
蒸馏水（mL）
1
0
0
0
DNS（mL）
3
3
3
3
置于沸水中加热反应10min
蒸馏水
加蒸馏水至20.5mL,摇均后静置10min
550nm处测OD值
3．蛋白质测定测定
采用考马斯亮兰G—250法（Bradford比色法）。
CK
样品1
样品2
样品3
样品（mL）
0
0.5
0.5
0.5
蒸馏水（mL）
1
0.5
0.5
0.5
考马斯亮兰G—250（mL）
5
5
5
5
混合均匀，静置10min。
595nm处测OD值
五．操作步骤
1．将菌种放在适温条件下进行活化。
2．按照实验要求配制所需的试剂，备用。
3．每组清洗17个250ml的三角瓶，烘干备用。
4．配制15瓶发酵培养基，另外2瓶中分别在装入蒸馏水（100ml）和玻璃珠（40个）；5ml、10ml移液管各2支，玻璃棒2支，上述物品按要求包扎好后一起放入灭菌锅中121℃下灭菌20min，冷却备用。
5．孢子悬液的制备：
每组3支菌种。
分别移取10ml无菌水到每支菌种中，用无菌接种针或铲等在试管斜面上轻轻铲动。
再将含有孢子的无菌水移取至含有玻璃珠的三角瓶中（事先已灭菌），在室温下120rpm振荡15min，使孢子分散均匀。
计数使得孢子浓度为5×106个/ml。
6．将上述孢子悬液接种3ml于三角瓶中，并用玻璃棒搅拌均匀后，包扎后贴上标签，置于28℃培养箱进行培养。
7．每隔24h取样，用0.2M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0）按一定（固液比1：
7——1：
10）的浸提比进行浸提1h，离心得粗酶液。
共取样7次。
8．分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。
六．实验结果与分析
1．以还原糖浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间还原糖的变化曲线。
还原糖
（mg/mL）
0
培养时间（h）
2．以氨基态氮浓度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。
氨基态氮
（mg/mL）
培养时间（h）
0
3．以淀粉酶活力为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。
淀粉酶活力
（IU/g干培养基）
0
培养时间（h）
七．思考题
1、测定淀粉酶可采用哪些方法？
2、比较固态发酵和液态发酵异同点。
实验三 细菌增殖曲线的测定
一．实验目的：
通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长曲线图
二．实验原理
大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20mln分裂一次。
将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。
以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。
不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。
测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。
三．菌种与培养基
菌种：
大肠杆菌
种子培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基
发酵培养基：
葡萄糖2g/L，Nacl2g/L，Na2HPO41.6g/L，（NH4）2SO41.6g/L，pH7.2。
四．仪器
光电比色计，摇床，冰箱
五．操作步骤
1、将在种子培养基中培养20h的培养液3000rpm离心10min倾去上层液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数系109/m1。
2．取2个盛发酵培养液的三角瓶，各接入3%菌液作种子，在摇床上相同位置30℃振荡培养，分别于培养0、1、2、3、4、5、6、7、8h等无菌取样5m1，装入无菌试管中置4℃下保存。
3．用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长600nm处比色，但要求消光度在0.3一0.6之间，若超过，用未接种培养液适当稀释。
六．实验结果：
1．结果
（1）将测定的OD600值填入下表
培养时间（h）
对照
0
1.5
3
4
5
6
7
8
9
10
12
光密度值OD600
（2）以菌悬液0D值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线．
OD600值
0
培养时间（h）
七．思考题
（1）如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?
两者各有什么优缺点?
（2）细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短?
若细胞密度为103／m1，培
养4.5h后，其密度高达2×108／m3，请计算出其代时。
（3）次生代谢产物的大量积累在哪个时期?
根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使
次生代谢产物积累更多？
实验四 啤酒麦芽汁的制备
一、实验目的：
1、了解啤酒生产的原料及基本过程。
2、掌握啤酒糖化的操作程序。
3、复习掌握啤酒生产过程中用到的理论知识。
二、实验原理：
啤酒的生产过程实际上就是酵母利用麦芽生长并产生酒精等的发酵过程。
在发酵的过程中，必须控制好以下几个条件：
适宜的微生物，控制微生物代谢的各种条件，微生物发酵的设备，精制成产品的方法和设备。
利用麦芽所含的各种水解酶（或外加酶制剂），在适宜的条件（温度、pH值、时间）下，将麦芽和辅料中的不溶性高分子物质逐步分解为可溶性低分子物质，这个过程称为糖化。
糖化过程中重要的物质分解有：
淀粉的分解，蛋白质的分解，β-葡聚糖的分解。
这些物质的分解主要依靠酶的作用，而酶发挥作用的决定性因素是温度和pH值。
淀粉的分解可以分为三个连续的不可逆过程，即糊化、液化和糖化。
糊化就是淀粉颗粒在热溶液中膨胀破裂的过程。
α-淀粉酶（β-淀粉酶）组成的淀粉长链迅速分解为短链，形成低分子糊精，从而使已糊化醪液的黏度迅速下降，形成稀的醪液，这个过程称为“液化”。
糖化就是指淀粉酶将淀粉转化为麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖等糖类和糊精的过程。
增加啤酒的生产流程工艺图
三、实验材料与方法：
1、实验材料：
碘、大麦芽、万能粉碎机、电子天平、搪瓷缸、水浴锅、温度计、2L烧杯、电磁炉、200目筛子，糖度计、玻璃棒等。
2、方法：
（1）麦汁糖度测定：
用100mL量筒取75mL麦汁，将比重糖度计放入量筒，读取与麦汁液面齐平的示数。
测量后将麦汁倒回去。
（2）糖化时间测定：
取麦汁置于白滴板上，再加上一滴碘液，混合，观察颜色变化。
直至碘液不变色为止，此时麦芽汁完成糖化，记录时间。
配置0.02mol/L碘溶液：
2.5g碘和5g碘化钾溶于水溶液中，稀释到1000mL。
四、实验步骤：
（一）、粉碎：
1、设备检查：
查看万能粉碎机料斗内有无杂质，磨盘、电线及其他附件是否正常，如无异常准备粉碎。
2、原料检验：
麦芽粉碎前，仔细检查麦芽外观质量，有无霉烂现象。
大麦芽应当即粉即用，不宜长时间保存，更不可过夜。
3、粉碎：
用电子天平称取150g左右大麦芽，放入粉碎机。
1min间断粉碎，达到“破而不碎”，同时控制粗、细粒比例约为1︰3。
（二）、糖化：
1、第一步糖化：
向1000mL搪瓷缸中加入500mL水，加入150g粉碎后的麦芽，加热至61℃，保持30min。
在糖化过程，每10min搅拌一次。
2、第二步糖化：
向第一步的搪瓷缸中加入加入400mL水，加热到68℃，保持30min。
在糖化过程，每10min搅拌一次。
（三）、过滤、洗糟
糖化过程结束后，麦芽和辅料中的高分子物质的分解已经完成，应迅速将糖化醪液中已溶解的可溶性物质和不溶性物质分离，以得到澄清麦汁，并获得良好的浸出物收得率。
1、过滤：
使用4～8层纱布进行固液分离。
过滤后，取样测原麦汁浓度，并记录。
2、洗糟：
使用300mL沸水沿滤层边冲洗。
（四）、煮沸、加酒花
1、煮沸：
对麦汁进行加热煮沸。
加热过程中每隔10min搅拌1次。
从麦汁沸腾时开始计时，煮沸时间30min，麦汁始终处于沸腾状态。
控制煮沸后麦汁体积为1000mL，即保持煮沸强度为8%～12%（煮沸强度时指在煮沸时每小时蒸发的水分相当于麦汁的百分数。
）控制沸终麦汁浓度9.5～10.5BX。
2、添加酒花
麦汁煮沸开始每隔10min依次添加0.2g/L苦型酒花、0.2g/L苦型酒花和0.4g/L香型酒花。
添加量共计为0.8g/L。
（五）、冷麦汁的制备
麦汁经煮沸并达到要求浓度后，要及时分离酒花，出去热凝固物，同时应在较短的时间内把它冷却到要求的温度（9℃左右），并设法出去析出的冷凝固物。
五、实验结果与分析
1、记录并计算糖化时间。
在糖化温度达到68℃记录时间，每隔5分钟用玻璃棒蘸取麦芽汁，置于白滴板上，再加上一滴碘液，混合，观察颜色变化。
直至碘液不变色为止，此时麦芽汁完成糖化，记录时间。
由糖化温度达到68℃到糖化完成结束，所需时间即为糖化时间。
2、按下式计算糖化用水量：
W=A（100—B）/B
式中B为过滤开始时的麦汁浓度（第一麦汁浓度）
A为100g原料中含有的可溶性物质（浸出物重量百分比）
W为100g原料（麦芽粉）所需的糖化用水量（mL）。
3、通过终沸麦汁浓度计算糖化率。
糖化率=终沸浓度*终沸体积/麦芽质量
六、思考题
1、麦芽的粉碎程度对过滤有什么样的影响？
2、麦汁制备的主要影响因素有哪些，应该如何避免麦汁的氧化？
3、糖化过程中各种酶的作用？
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