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不同种类啤酒中氨基酸含量的分析

[摘要]本论文是以啤酒为研究对象，探索不同种类啤酒中氨基酸的含量。

本实验先对啤酒进行预处理，之后对预处理后的样品进行研究。

啤酒中的氨基酸含量通过日立L-8900氨基酸全自动分析仪测定，该仪器灵敏、快速、提供数据准确可靠、分辨率高、操作简单、分析周期短。

通过一系列实验之后，得出精酿啤酒比市售啤酒的总游离氨基酸含量高，且精酿啤酒与市售啤酒中的脯氨酸含量均为最高；而且精酿啤酒相较于市售啤酒口感更佳；两种啤酒中部分必需氨基酸高于FAO/WHO理想氨基酸构成比例，而部分则低于FAO/WHO理想氨基酸构成比例。

[关键词]啤酒；氨基酸分析仪；游离态氨基酸

第一章绪论

啤酒主要由是麦芽、啤酒花、水等原料组成。

它是继饮用水和茶之后人类饮用的第三大饮料[1]。

啤酒约含有17种氨基酸，其中7种是必不可少的，不是人体合成且必不可少的氨基酸。

啤酒中的氨基酸有两种形式：

1.以蛋白质或蛋白质的形式存在2.存在于溶解状态的啤酒中。

啤酒中的游离氨基酸含量越高，越接近人体蛋白质的氨基酸组成，消化吸收时人体的营养价值越高。

课题旨在通过对不同种类啤酒游离氨基酸含量的测定，确定啤酒中含有氨基酸，并比较精酿啤酒与市售啤酒中游离氨基酸不同，为了获得更高含量的啤酒中的游离氨基酸。

“工业啤酒”：

当麦芽汁和啤酒花煮沸至10°C以下时，添加制作Lager型啤酒的酵母，但添加后，它会下沉至麦芽汁的最低端。

发酵罐也较大，可实现批量生产，发酵时间短，一般为7天，以控制时间成本。

过滤和母线灭菌将在发酵后进行，以延长啤酒的保质期。

“精酿啤酒”：

当将麦芽汁和啤酒花煮沸并冷却至15℃时，加入制造Ale型啤酒的酵母。

添加后，将在麦芽汁顶部开始发酵，发酵时间更长，一般需要2个月左右。

为了确保啤酒的原始风味和味道，通常在发酵后不进行过滤和灭菌。

1.1啤酒的营养价值

　⑴啤酒含有多种氨基酸：

啤酒约有十多种氨基酸，其中，光我们人体必需吸收的氨基酸就有7种，仅缺色氨酸这一种。

⑵啤酒发热量大：

经营养学家换算，按12.0°P的啤酒发热量430千卡/升上下计，1L啤酒的能量相当于5-6个鸡蛋、0.75L牛奶、250g面包、500g马铃薯所产生的能量。

按人体60kg体重消耗2000-2500kcal/d的能量计，5L啤酒足够人体一天的能量消耗[2]。

⑶助消化：

啤酒主要含有大麦、醇类、酒花成分和多酚等物质，可以促进胃液分泌，提高人体的消化吸收能力。

⑷啤酒，特别是黑啤酒，经常饮用有很好的保健效果，可以降低动脉硬化和白内障50%左右的发病率，并对心脏病有拮抗作用。

⑸利尿：

经常饮用啤酒可以加快人体的新陈代谢活动。

⑹长期饮用啤酒，能够减少年迈后患骨质疏松症的几率。

我们人体的骨密度和硅摄取量密切相关，由于啤酒中含有大量的硅，长期饮用啤酒有利于保持骨骼健壮。

1.2本课题目前国内外研究情况

氨基酸定义：

氨基酸是生物功能性的大分子中蛋白质的基本组成部分，是地球上所有动物所需营养蛋白质的基本物质。

氨基酸分析仪的定义；氨基酸分析仪已进入国内市场近30年。

它是一种专用于测定蛋白质水解产物（水解氨基酸）和生理体液（游离氨基酸）的氨基酸含量的专用仪器。

现诸多行业也广泛运用。

它与其他分析仪器的不同之处在于它只能检测不能使用的氨基酸，因为它是特异性的。

从仪器本身的配置来看，应配备少量输液系统和特殊的阳离子树脂氨基酸分离柱及专用检测器，它的反应系统和检测方法才符合国际标准（离子交换后三酮衍生化方法）。

用于确定样品中氨基酸含量的组成的仪器称为氨基酸分析仪。

氨基酸分析仪只能测量单个氨基酸，而不能测量蛋白质或多肽[3]。

氨基酸分析的经典方法即离子交换柱法，最初是由Stein及Moore两人在1951年建立的[4]。

尽管在发展过程中有不少改进，但人类至今一直沿用其原理。

随着人类科学的不断发展进步，氨基酸分析在生命科学研究领域中发挥着很重要的技术作用。

早在上世纪50年代，约翰·杰克逊·斯帕克曼等学者便首次介绍了离子交换色谱柱结合柱后茚三酮衍生化分析氨基酸的方法，并介绍了第一个氨基酸分析仪[6]。

从上世纪50年代起氨基酸分析仪就得到了很大的发展，尤其是在高压液相色谱和微处理器的开发和应用方面。

分析的准确性和自动化程度得到了很大提高，成为现代仪器分析的重要手段[7]。

目前常用的检测氨基酸的方法有液相色谱法[8-9]、气相色谱法[10-12]、毛细管电泳法[13-14]、核磁共振法[15]和离子色谱法[16-17]等。

在大众啤酒日益饱和的背景下，随着消费者更加关注啤酒产品的质量，口味，安全性和新鲜度，具有丰富层次，品味和个性的产品越来越受到消费者的青睐。

“精酿”以其高品质和醇厚的口感满足了消费者的期望。

精酿啤酒将成为国内啤酒市场的未来和趋势。

中国的精酿啤酒始于上世纪末，只是为了促进当地产品在小范围内的整合。

后来，随着人们生活水平的提高和对优质啤酒的追求，再加上来自世界市场的影响，在2008年之后，一批有意识的工匠出现并发展到中国几乎所有主要城市。

精酿啤酒与普通工业啤酒有很大差异，这反映在原料，风味和营养价值，保鲜时间等方面。

工艺啤酒比普通工业啤酒具有更高的质量要求[18]。

精制啤酒具有丰富而浓重的味道，来自发酵过程中高浓度的麦芽汁。

不同类型的精酿啤酒具有不同的发酵周期，但一般来说，精酿啤酒的发酵周期比普通工业啤酒的发酵周期长。

1.3本课题研究意义及内容

该项目的切入点是啤酒研究。

进而区分精酿啤酒与市售啤酒中游离氨基酸的不同及啤酒的原料中哪种原料所分解的氨基酸更多，对人体更有益。

为研究啤酒中的氨基酸提供基础。

本项实验中啤酒的前处理采用的是磺基水杨酸法去除啤酒中的蛋白质，其它能去除啤酒中蛋白质从而获得游离氨基酸的方法有以下几种：

1、苦味酸法：

用配制成1%的苦味酸溶液，将样品与苦味酸溶液按一定比例混合，静置后生成白色蛋白质沉淀物，然后放入离心机中万转离心15分钟以上，将上清液取出加入到已制备好的去除苦味酸的离子交换树脂中，苦味酸被吸附于树脂上而得以除去，将含有氨基酸的溶液收集备用。

提示：

该方法很麻烦，必须预先制备吸附苦味酸的离子交换树脂。

2、三氯醋酸法：

通过向样品中添加浓度为5％至10％的三氯乙酸来沉淀蛋白质。

提示：

这些沉淀剂通常用于沉淀血浆中的蛋白质。

3、乙醇沉淀法：

当将乙醇加入到含有蛋白质的水溶液中时，蛋白质的表面会失去水膜，并且颗粒之间的吸引力增加，导致蛋白质沉淀。

提示：

除蛋白不彻底。

本实验中使用的HitachiL-8900氨基酸自动分析仪的特点是：

1、灵敏，快速，准确可靠的数据，高分辨率，操作简单，分析周期短（水解30分钟，体液110分钟）。

2、保留时间，峰面积，重现性，检出限可达3pmol。

3、产生二级衍生物的夜间方法没有问题。

4、峰形显示高斯分布，系统稳定（半小时）[19]。

日立L-8900氨基酸自动分析仪应用：

①测定茶氨酸来鉴别真伪茶叶。

②对农作物进行检测。

③根据必需氨基酸的比例配置饲料，以监督产品

L-8900氨基酸全自动分析仪技术参数：

1.性能：

1）净分析时间约30分钟2）保留时间重现性CV0.3%（精氨酸）3）峰面积重现性CV1.0%（甘氨酸，组氨酸）4）检出限3pmol（信噪比=2，天冬氨酸）

2.氨基酸分析仪主机：

1）色谱柱尺寸:

4.6mmID×60mm粒度：

3μm树脂：

日立专用离子交换树脂，2）输液泵方式：

微量型串联式双柱塞往复泵压力：

0-29.9Mpa流量：

0.000-0.999ml/min（增量：

0.001ml/min），3）自动进样器进样方式：

直接进样样品瓶容积：

1500μl样品瓶数量：

200（选配：

带制冷装置，200）进样量：

0.1-100μl，4）柱温箱方式：

半导体制冷加热温度设定：

20-85℃（增量:

1℃）有断电和散热器过热保护装置，5）反应单元方式：

反应柱尺寸：

4.6mmIDx40mm填充材料：

金刚砂惰性材料温度范围：

50-140℃（增量：

1℃）有过热断电保护装置，6）可见光度计:

单色器：

消相差凹面衍射光栅波长：

570nm,440nm（700nm参比）

3.自动支持功能：

1）N2自动鼓入,2）N2压力控制,3）茚三酮回流保护装置

4.系统管理：

1）操作系统32位操作系统,WindowsXP，2）显示屏17''显示器（LCD选配）

5.外观尺寸（不包括计算机）：

900×650×1050mm（W×D×H）

6.重量约180公斤

7.环境温度15-35℃

8.电源：

100-115VAC/220-240VAC,≥800VA,W/in50/60Hz±0.5Hz

9.氮气用户自备NOTE：

色谱柱的规格：

标准分析：

4.6mmIDx60mm，高速分析：

4.6mmIDx40mm，高分辨率分析：

4.6mmIDx80mm。

第二章实验部分

2.1主要实验仪器

表2.1主要实验仪器

主要实验仪器

型号

生产厂家

氨基酸全自动分析仪

L-8900型

日本日立有限公司

离心机

TG18-WS

长沙湘锐离心机有限公司

电子天平

Quintix35-1

赛多利斯（sartorius）贸易有限公司

移液枪

TopPette

大龙兴创实验仪器有限公司

2.2主要实验材料

表2.2试剂名称规格及生产厂家

试剂名称

试剂纯度

生产厂家

磺基水杨酸

浓盐酸

蒸馏水

分析纯

﹋﹋﹋﹋

上海阿拉丁生化科技股份有限公司

洛阳昊华化学试剂有限公司

娃哈哈纯净水

2.3啤酒的取样

精酿啤酒样品取自京德精酿啤酒：

①原料：

小麦、大麦、深焦麦，发酵时间：

15天，②原料：

大麦、深焦麦、巧克力麦、黑麦，发酵时间：

6个月多，③原料：

大麦，发酵时间：

2个月多，④原料：

大麦、小麦，发酵时间：

15天。

市售啤酒：

①青岛啤酒②百威啤酒③崂山啤酒④哈尔滨啤酒⑤格林菲特啤酒

2.4实验方法及步骤

2.4.1氨基酸分析仪的操作原理

1958年，斯坦和摩尔独立发明了离子交换分离，茚三酮柱衍生的氨基酸自动分析仪，并于1972年获得诺贝尔奖。

保留在柱上的氨基酸由洗脱液的pH值，离子强度，柱温和氨基酸本身的性质分开。

该仪器通过精确控制各种分离和衍生条件来确保定性和定量的可重复性。

分离：

阳离子交换柱利用氨基酸的不同pH变化，将氨基酸用柠檬酸盐缓冲液的不同pH变化逐个洗涤，酸性氨基酸<羟基氨基酸<中性氨基酸<芳香族氨基酸<碱性氨基酸。

茚三酮反应原理：

茚三酮反应：

茚三酮与氨基酸仪一起加热，形成深蓝紫色复合物，最大吸收波长570nm。

图2.1茚三酮与氨基酸的反应

茚三酮与脯氨酸反应不产生NH3，直接生成黄色化合物，吸收波长在440nm。

2.4.2氨基酸分析仪的色谱分析条件

色谱分析条件：

分析柱是Na型离子交换色谱柱（4.6mm×60nm，3μm），流动性为锂盐缓冲液，双通道检测，缓冲液流速0.40mLmin-1;茚三酮溶液流速0.35mLmin-1;检测波长:

检测脯氨酸的波长为440nm，检测波长为570nm的其他氨基酸[19]。

色谱柱柱温设置50℃；保护柱温度57℃;反应柱温度135℃;柱后衍生化，衍生剂为茚三酮缓冲液，反应温度为135℃。

标准溶液和测试溶液均以20μL注射。

2.4.3样品前处理

取1mL样品加入0.02mol/L的盐酸稀释到一定体积（体积根据样品氨基酸含量而定）加入10mg磺基水杨酸，静置30min，高速离心5min（5000r以上），并用0.22μm过滤器过滤上清液。

上机。

[20-22]

2.4.4上机

按照此仪器说明书和操作规范上机操作，严格按照外标法定量，将混合氨基酸标准工作液进样测定，得到相应的峰面积，以标样质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别绘制出17种氨基酸的标准曲线，从而获得相应的回归方程和线性相关系数[23-25]。

将待测液进样，利用标准曲线查出啤酒中各种氨基酸的含量

2.5结果与讨论

2.5.1氨基酸标准溶液色谱图

图2.2氨基酸标准溶液色谱图

将17种氨基酸混合标准溶液在上述氨基酸分析仪条件下测定,脯氨酸440nm波长测定,其余16种氨基酸在570nm波长下测定,17种氨基酸标样色谱图见图2.2。

从图中可以看到17种氨基酸在30min内完成测定,17种氨基酸在该色谱条件体现良好。

2.5.2四种精酿啤酒的氨基酸色谱图

图2.3精酿啤酒1氨基酸色谱图

图2.4精酿啤酒2氨基酸色谱图

图2.5精酿啤酒3氨基酸色谱图

图2.6精酿啤酒4氨基酸色谱图

有图2.3-2.6得到四种精酿啤酒的氨基酸色谱图，其中明显看到精酿啤酒1不含Cys和Met，精酿啤酒2不含Ile，精酿啤酒3不含Cys、Met、Ile、Leu和Arg，精酿啤酒4不含Cys、Met、Ile、Leu和Arg。

2.5.3精酿啤酒的氨基酸含量

表2.3四种精酿啤酒的氨基酸含量

项目

氨基酸含量/（mg/L）

精酿啤酒1

精酿啤酒2

精酿啤酒3

精酿啤酒4

天冬氨酸Asp

55.055

26.565

40.680

25.600

苏氨酸Thr

9.490

22.280

6.540

4.435

丝氨酸Ser

33.480

31.715

28.350

20.975

谷氨酸Glu

76.170

70.220

64.500

61.065

甘氨酸Gly

52.830

56.755

48.140

46.975

丙氨酸Ala

112.200

82.005

69.545

70.425

胱氨酸Cys

0.000

43.855

0.000

缬氨酸Val

143.410

129.970

47.035

59.445

蛋氨酸Met

0.000

4.695

0.000

异亮氨酸Ile

15.440

0.000

亮氨酸Leu

38.280

41.030

0.000

酪氨酸Tyr

170.665

124.595

133.900

128.325

苯丙氨酸Phe

157.725

209.935

107.400

115.545

赖氨酸Lys

3.060

29.525

10.230

6.400

组氨酸His

27.340

24.050

25.470

26.870

精氨酸Ary

36.190

29.855

0.000

脯氨酸Pro

563.640

656.665

551.330

583.875

氨基酸总量

1494.975

1583.715

1133.120

1149.935

必需氨基酸含量

367.405

437.435

278.605

185.825

味觉氨基酸含量

332.445

265.400

222.865

204.065

由表2.3得出精酿啤酒1共有15种游离氨基酸，精酿啤酒2共有16种游离氨基酸，精酿啤酒3共有12种游离氨基酸，精酿啤酒4共有12种游离氨基酸，四种精酿啤酒中均属脯氨酸含量最高。

四种精酿啤酒总氨基酸含量从高到低依次是：

精酿啤酒2、精酿啤酒1、精酿啤酒4、精酿啤酒3。

从这一方面看精酿啤酒4的营养价值更高。

啤酒中所包含的必需氨基酸包括7种苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，四种精酿啤酒中必需氨基酸含量从高到低依次是：

精酿啤酒2、精酿啤酒1、精酿啤酒3、精酿啤酒4。

从这一方面看精酿啤酒4的营养价值更高。

通过四种精酿啤酒的测试结果相比发现，小麦发酵后不产生游离态的蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸或者是发酵时间不够，导致蛋白质未水解而没有游离态的蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸。

大麦、小麦、深焦麦发酵都不产生半胱氨酸。

味道的鲜美程度由食物中鲜味氨基酸的含量和组成来决定。

[26]鲜味氨基酸包含有天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸5种。

所以四种精酿啤酒中精酿啤酒1口感更佳。

2.5.4五种市售啤酒的氨基酸色谱图

图2.7市售啤酒1的氨基酸色谱图

图2.8市售啤酒2的氨基酸色谱图

图2.9市售啤酒3的氨基酸色谱图

图2.10市售啤酒4的氨基酸色谱图

图2.11市售啤酒5的氨基酸色谱图

由图2.7-2.11得到市售啤酒1不含Cys和Met，市售啤酒2不含Cys和Met，市售啤酒3不含Cys和Met，市售啤酒4不含Cys、Met、Ile、Leu和Arg，市售啤酒5不含Cys和Met。

2.5.5市售啤酒的氨基酸含量

表2.4五种市售啤酒的氨基酸含量

项目

氨基酸含量

市售啤酒1

市售啤酒2

市售啤酒3

市售啤酒4

市售啤酒5

天冬氨酸Asp

6.500

20.556

5.652

2.884

1.440

苏氨酸Thr

2.868

3.642

0.441

2.494

3.885

丝氨酸Ser

6.063

9.069

2.974

6.288

5.441

谷氨酸Glu

36.836

36.990

29.831

16.508

18.286

甘氨酸Gly

30.422

24.572

19.834

17.141

16.644

丙氨酸Ala

83.196

71.618

63.146

39.591

53.816

胱氨酸Cys

0.000

缬氨酸Val

79.169

36.555

53.040

22.318

34.384

蛋氨酸Met

0.000

异亮氨酸Ile

15.593

7.667

9.217

0.000

5.133

亮氨酸Leu

28.737

17.949

19.200

0.000

12.952

酪氨酸Tyr

70.772

37.544

26.443

28.963

34.498

苯丙氨酸Phe

106.833

52.795

54.630

14.766

48.941

赖氨酸Lys

13.388

2.865

9.106

0.405

3.290

组氨酸His

23.420

15.513

17.495

9.047

11.541

精氨酸Ary

59.673

6.679

28.477

0.000

13.071

脯氨酸Pro

340.244

254.210

208.259

193.864

167.625

氨基酸总量

904.714

598.044

547.745

357.269

430.947

必需氨基酸含量

246.588

121.473

145.634

39.983

108.585

味觉氨基酸含量

216.647

160.415

146.940

76.124

103.257

由表2.4得出市售啤酒1共有15种游离氨基酸，市售啤酒2共有15种游离氨基酸，市售啤酒3共有15种游离氨基酸，市售啤酒4共有12种游离氨基酸，市售啤酒5共有12种游离氨基酸，五种市售啤酒均属脯氨酸含量最高。

五种市售啤酒总氨基酸含量从高到依次是：

市售啤酒1、市售啤酒2、市售啤酒3、市售啤酒5市售啤酒4，从这一方面看市售啤酒1营养价值更高。

五种市售啤酒必须氨基酸含量从高到依次是：

市售啤酒1、市售啤酒3、市售啤酒2、市售啤酒5、市售啤酒4，从这一方面看市售啤酒1营养价值更高。

五种市售啤酒鲜味氨基酸含量从高到依次是：

市售啤酒1、市售啤酒2、市售啤酒3、市售啤酒5、市售啤酒4，从这一方面看市售啤酒1口味更佳。

2.5.4精酿啤酒与市售啤酒的氨基酸含量的比较

由表2.3与表2.4得出四种精酿啤酒的游离氨基酸总量均比五种市售啤酒的游离氨基酸总量高，但是市售啤酒1的必需氨基酸含量却超过了精酿啤酒3、4；市售啤酒1的味觉氨基酸含量超过了精酿啤酒4，这可能与啤酒的原料与生产工艺有关。

2.5.5啤酒中的必需氨基酸比例与FAO/WHO理想氨基酸构成模式的比较

表2.5不同种类啤酒中必需氨基酸模式比例比较表%

项目

Thr

Val

Met+Cys

Ile

Leu

Lys

Phe+Tyr

WHO/FAO模式

4.00

5.00

3.50

4.00

7.00

5.50

6.00

精酿啤酒1

0.632

9.593

1.033

2.561

0.204

21.966

精酿啤酒2

1.407

8.202

3.066

2.591

1.864

21.123

精酿啤酒3

0.577

4.151

0.903

21.295

精酿啤酒4

0.386

5.169

0.557

21.207

市售啤酒1

0.317

8.751

1.723

3.176

1.479

19.627

市售啤酒2

0.609

6.112

1.282

3.001

0.479

15.156

市售啤酒3

0.080

9.683

1.683

3.505

1.662

14.801

市售啤酒4

0.698

6.247

0.113

12.240

市售啤酒5

0.902

7.979

1.191

3.005

0.763

19.362

如表2.5所示，不同种类啤酒中缬氨酸基本符合粮农组织/世界卫生组织理想氨基酸构成比例；而苯丙氨酸+酪氨酸远远超过FAO/WHO理想氨基酸构成比例；其他如苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸则不符合FAO/WHO理想氨基酸构成比例。

2.4.6不同种类啤酒必须氨基酸的RAA、RC分析

表2.6不同种类啤酒必须氨基酸的RAA、RC

种类

RAA/RC

Thr

Val

Met+Cys

Ile

Leu

Lys

Phe+Tyr

精酿啤酒1

0.158

1.919

0.258

0.366

0.037

3.661

RAA

0.632

9.593

1.033

2.561

0.204

21.966

精酿啤酒2

0.352

1.640

0.876

0.370

0.339

3.521

RAA

1.407

8.202

3.066

2.591

1.864

21.123

精酿啤酒3

0.144

0.830

0.164

3.549

RAA

0.577

4.151

0.903

21.295

精酿啤酒4

0.097

1.034

0.101

3.535

RAA

0.386

5.069

0.557

21.207

市售啤酒1

0.079

1.750

0.431

0.454

0.269

3.271

RAA

0.317

8.751

1.723

3.176

1.179

19.627

精酿啤酒2

0.152

1.222

0.321

0.429

0.087

2.526

RAA

0.609

6.112

1.282

3.001

0479

15.156

精酿啤酒3

0.020

1.937

0.421

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