水貂阿留申病毒VP2基因的克隆及原核表达.docx

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水貂阿留申病毒VP2基因的克隆及原核表达

本科生毕业论文（设计）

题目:

水貂阿留申病毒VP2基因的克隆及原核表达

姓名:

韩蓉

学院:

动物医学院

专业:

动物医学

班级:

动医54班

学号:

1715428

指导教师:

雷治海职称:

教授

姜焱职称:

高级兽医师

2010年5月18日

南京农业大学教务处制

目录

摘要…………………………………………………………………………………………1

关键词…………………………………………………………………………………………1

Abstract………………………………………………………………………………………1

Keywords……………………………………………………………………………………1

引言（或绪论）………………………………………………………………………………1

1　材料与方法………………………………………………………………………………1

1.1　材料……………………………………………………………………………………1

1.2　方法……………………………………………………………………………………2

1.2.1　ADV的VP2基因的PCR扩增…………………………………………………………2

1.2.2　VP2基因与T载体的连接……………………………………………………………2

1.2.3　pET-VP2重组表达载体的构建………………………………………………………3

1.2.4　BL21VP2诱导表达比较……………………………………………………………4

2　结果与分析………………………………………………………………………………5

2.1　vp2基因的PCR结果……………………………………………………………………5

2.2　PT-VP2重组质粒的酶切鉴定…………………………………………………………5

2.3　pET-VP2重组质粒的构建………………………………………………………………62.4　BL21VP2E.coli重组蛋白表达…………………………………………………………63　讨论………………………………………………………………………………………63.1　本实验的研究意义……………………………………………………………………63.2　本实验的优化条件……………………………………………………………………73.2.1　PCR条件的优化………………………………………………………………………73.2.2　目的基因片段与表达载体pET-32a（+）连接的优化………………………………73.2.3　诱导表达条件的优化………………………………………………………………7致谢…………………………………………………………………………………………7

参考文献……………………………………………………………………………………7

水貂阿留申病毒VP2基因的克隆及原核表达

动物医学专业学生韩蓉

指导教师雷治海

摘要：

水貂阿留申病（AD）又称浆细胞增多症，是由水貂阿留申病细小病毒（ADV）持续感染引起的一种水貂自身免疫系统紊乱，同时并发自身免疫慢性病毒血症。

根据Genebank上的水貂阿留申病病毒的VP2基因序列，设计了一对引物，通过PCR方法扩增了完整的VP2基因，将PCR产物插入pET-32a（+）载体中，构建成重组原核表达载体pET-VP2。

阳性重组质粒转化宿主菌BL21（DE3）中感受态细胞，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测，结果表明表达产物的分子质量约为21kD。

成功表达了VP2蛋白，为VP2蛋白的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。

关键词：

水貂阿留申病病毒；VP2基因；原核表达

CloningandProkaryoticExpressionOfMainAntigenicRegionOfVP2GeneofAleutianMinkDiseaseParvovirus

studentmajoringinveterinarymedicineHanRong

tutorLeiZhihai

Abstract：

Aleutianminkdisease（AD），alsoknownasminkplasmacytosis．Itiscausedbyapersistent

infectionwithAleutianminkdiseasevirus（ADV），anondefectiveparvovirus．ADiskindofmainlyenc-

roachestheimmunocyteofmink，resultsinimmunesystemdisordersandsimultaneouswithautoimmuneviremiadisease．AccordingtothesequenceoffullgenomeofVP2publishedonGenebank，wedesignedapairofprimerstoamplifyfullVP2genebyPCR．ThisPCRproductisinsertedintopET-32a（+）toconstructpET-VP2．ThepositiverecombinantvectorsweretransformedintorecipientgermsBL21（DE3）forexpress-

ionbyIPTGinducing．TheexpressedproteinsweremeasuredbySDS-PAGE．Theresultsshowedthatthemolecularweightoftheexpressedproteinswereseparately21KD．VP2proteinWassuccessfulexpressed．ItlaidafoundationofstudyonroleofVP2inpathopoiesisofvirusesanddevelopmentofrelevantvaccine．

Keywords:

Aleutianminkdiseasevirus；VP2genes；Prokaryoticexpression

水貂阿留申病（AleutianDiseaseofMink，AD）是由水貂阿留申病毒（AleutianMinkDiseaseVirus，ADV）引发的一种水貂慢性进行性疾病。

梁士哲等1982年报道了该病在我国的发生[1]，目前在全国范围内仍广泛流行，是当今阻碍养貂业发展的主要传染病，以繁殖能力下降、貂体消瘦、自身免疫病、高免疫球蛋白血症、细菌感染的易感性增加、肾衰竭死亡为基本特征[2]。

临床上病理综合征表现为母貂流产、新生仔貂急性肺炎、成年水貂慢性免疫复合物介导的肾小球肾炎[3]，ADV属细小病毒科（Parvovirdae）细小病毒属（Parvovirus）[4]。

ADV的基因组为线性单链DNA，ADV病毒粒子中的蛋白分为结构和非结构蛋白2类。

基因组全长为4801bp，主要编码VP1和VP2两种结构蛋白。

VP1和VP2共同构成病毒粒子的衣壳粒，而VP2在病毒衣壳中占有绝大部分的比重，病毒粒子蛋白的结构功能也主要集中在VP2蛋白上[5-7]。

由于VP2基因的可变性和相对保守性及其与致病性的相关性，该基因成为研究ADV毒力和致病机理等的首选基因[8]。

本研究就ADV国内分离株的VP2基因主要抗原区进行了克隆与表达，为VP2蛋白功能与作用的深入研究积累资料，同时为进一步揭示ADV抗原表位的分子特征奠定基础。

1材料和方法

1．1材料

1.1.1水貂阿留申病毒

由江苏出入境检验检疫局动植物检测中心实验室姜焱博士保存。

1.1.2质粒及菌株

T载体，pET-32a表达载体[及其宿主菌BL21（DE3）]，都由江苏出入境检验检疫局动植物检测中心实验室姜焱博士保存。

1.1.3各种试剂

质粒抽提试剂盒、rTaq和各种限制性核酸内切酶均购自于Takara公司；pGemT-Easy试剂盒，购自Promega公司；LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白为Oxoid产品。

每1000mLLB液体培养基含有10g胰化蛋白胨、5g酵母浸出物和10gNacl抗性培养基的氨苄青霉素终浓度为100μg/μL。

固体培养平板为LB液体培养基加入1.6%琼脂，分装平皿后灭菌。

TAE电泳缓冲液参照《分子克隆实验指南》（第二版）配制[9]。

1.1.4引物

参考已发表的ADVVP2基因核苷酸序列，利用Primer5.0软件分别设计合成两对引物，用于扩增VP2上主要抗原表位区的两个核酸片段；

P1:

（5’-TACggATCCTgCAAACCAAAgACAgAT-3’）

P2:

（5’-gCggAATTCggTTTTTATTCTgTCTgg-3’）

1.1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂

丙烯酰胺、NN＇-亚甲基双丙烯酰胺，按照如下比例配制：

总体积100mL中含有29g丙烯酰胺和1gNN＇-亚甲基双丙烯酰胺。

用纯水配制，并置于棕色瓶中，4℃保存。

TEMED（四甲基乙烯二胺），购自Promega公司。

10%SDS（十二烷基苯磺酸钠）、10%过硫酸铵溶液、2×上样缓冲液、考马斯亮蓝R-250染色液和脱色液等，均参照《分子克隆实验指南》（第二版）[9]自行配制。

1.1.6主要仪器

PCR仪：

AmpGene公司生产，DNAThermolCycler4800型；V-16夹心垂直电泳槽：

上海精益有机玻璃制品仪器厂生产；THZ-C空气恒温震荡器：

江苏太仓光明实验分析仪器厂产品；TY-80S型脱色摇床：

南京大学南达生物技术开发公司；SCR-6型稳定电泳仪，江苏丹阳无线电一厂；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽高压锅：

上海申安医疗器械厂。

1．2方法

1.2.1ADV的VP2基因的PCR扩增

ADV的VP2基因的PCR扩增,优化体系为：

超纯水33μL、10×PCRBuffer5μL、dNTPsMix4μL、1.5mMMgCl24μL、上游引物1μL、下游引物1μL、Taq酶1μL、

反应程序为：

95℃3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环，然后72℃延伸10min，最后置于4℃。

反应结束后，取8μLPCR产物在10g/L琼脂糖凝胶上进行电泳。

1.2.2VP2基因与T载体的连接

1.2.2.1coliDH5感受态细胞的制备

用接种环蘸取冻存于-20℃的DH5α甘油菌少许，并划线接种于琼脂LB平板上，倒置于温箱中，37℃培养24h；待平板上长出单个菌落，挑取形态均一的单个菌落，接种于含3mLLB的试管中，37℃振荡培养，待其细菌浓度达到约0.5~0.6时，参照《分子克隆实验指南》（第二版），制备感受态细胞，其具体过程如下：

取约1.5mL细菌于1.5mLEppendorf管中，3800rmp离心4min，收集细菌，用400μL0.1MCaCL2轻轻吹打开细菌，并置于冰水混合物中水浴5min，取出，将离心管于3800rmp离心4min收集细菌，小心吹打开细菌并用200μL0.1MCaCL2小心吹打开细菌，再置于冰水混合物中水浴1h，即得感受态细胞。

该细胞可以立即使用，也可以加入甘油于-20℃冻存备用。

1.2.2.2PCR产物的小量胶回收试剂盒法回收

反应产物于1.2%琼脂电泳，切下目的条带，按小量胶回收试剂盒说明书进行回收目的片段，其过程为：

称量所切下胶块的重量，按照100mg胶块：

300μL溶胶液的比例加入溶胶液。

如胶块重量不足100mg，可以加入纯水补足；将混合物在75℃水浴10min，中间每隔2min取出EP管颠倒一次以使胶块充分溶解。

将溶解后的混合物吸入收集管，12000rmp离心1min，用洗涤液先后洗涤两次，每次用500μL，并于12000rmp离心1min，最后在收集管膜中央部位加入25μL洗脱液，放置2min，12000rmp离心1min，收集离心所得液体。

该洗脱液中即含有所有的DNA片段。

1.2.2.3外源片段和T载体的连接、转化

在RNA/DNACalculator上测定该溶液中DNA含量，与T载体连接（操作步骤见pGemT-Easy试剂盒）。

外源片段和T载体连接的优化体系为：

外源DNA8.5μL、T载体0.5μL、2×连接Buffer10μL、T4DNA连接酶1μL、

使外源DNA和T载体的摩尔比例大约为3：

1，将上述连接体系于掌式离心机上稍作混合，置于16℃连接过夜。

取出，转化方法参考文献[9]。

其过程如下：

将连接产物吸入至感受态细胞中，轻摇混匀，置于冰水混合物中水浴30min，42℃热冲击90sec，再冰水浴2min。

加入LB液体培养基800μL，37℃振摇45min。

12000rmp离心1min收集细菌，均匀涂布于氨苄平板上。

37℃温箱中培养24h。

1.2.2.4小量试剂盒提取质粒

用购自Takara公司的质粒小量抽提试剂盒提取50μL的质粒。

1.2.2.5酶切鉴定重组质粒

将所提的质粒，取出10μL用EcoRⅠ和BamHⅠ作酶切鉴定。

酶切体系为：

超纯水6μL、质粒10μL、10×KBuffer2μL、EcoRⅠ1μL、BamHⅠ1μL、

混匀上述反应体系，并置于37℃水浴3h。

将酶切产物于1.2%琼脂凝胶上电泳，在紫外投影仪上检测电泳结果。

将阳性质粒命名为pT-VP2。

1.2.3pET-VP2重组表达载体的构建

1.2.3.1含pET-32a（+）质粒DH5αE.coli的增殖和pET-32a（+）的提取

用接种环蘸取冻存于-20℃的含pET-32a（+）质粒DH5αE.coli甘油菌少许，并划线接种于含氨苄的琼脂LB平板上，倒置于温箱中，37℃培养24h；待平板上长出单个菌落，挑取形态均一的单个菌落，接种于含20mLLB的试管中，37℃振荡过夜培养。

用试剂盒小量提取质粒；并于1.2%琼脂凝胶上电泳以鉴定质粒大小和浓度。

1.2.3.2回收表达载体pET-32a（+）的双酶切产物

将表达载体pET-32a（+）进行EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，其酶切反应体系为：

超纯水6μL、质粒10μL、10×KBuffer2μL、EcoRⅠ1μL、BamHⅠ1μL

混匀上述反应体系，并置于37℃反应2~3h，酶切产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳将

目的片段切下，按DNA小量凝胶回收试剂盒回收说明书回收目的片段。

1.2.3.3克隆载体pT-VP2的双酶切及目的片段的回收

将克隆载体pT-VP2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，其酶切反应体系为：

超纯水6μL、pT-VP210μL、10×KBuffer2μL、EcoRⅠ1μL、BamHⅠ1μL

混匀上述反应体系，37℃反应2~3h，酶切产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，将目的片段切下，按DNA小量凝胶回收试剂盒回收说明书回收目的片段。

1.2.3.4目的基因片段与表达载体pET-32a（+）的连接

将阳性的克隆pT-VP2经双酶切及目的片段回收，与经相应双酶切及回收的pET32a表达载体进行连接反应，将阳性克隆命名为pET-VP2见图1。

VP2

+

Vp2vp2vp2vp2

VP2

目的

基因

载体

图1VP2基因插入pET-32a（+）载体中，构建成重组原核表达载体pET-VP2

Fig.1VP2genesisinsertedintopET-32a

toconstructpET-VP2

pET-VP2

连接反应优化体系为：

pET-32a（+）5μL、10×Ligasebuffer2μL、T4DNANLigase1μL、目的基因片段12μL、

混匀上述反应体系，在冰水混合物环境下连接过夜。

1.2.3.5BL21（DE3）感受态细胞的制备

用接种环蘸取冻存于-20℃的BL21（DE3）甘油菌少许，并划线接种于琼脂LB平板上，倒置于温箱中，37℃培养24h；待平板上长出单个菌落，挑取平板上单个菌落，扩大培养至OD℃值为0.5~0.6，用0.1MCaCL2制备感受态细胞。

1.2.3.6转化

吸出过夜连接产物8μL，转移至BL21（DE3）感受态细胞中，轻摇混匀，置于冰水混合物中水浴30min，42℃热冲击90set，再冰水浴2min。

加入LB液体培养基800μL，37℃振摇45min，12000rmp离心1min收集细菌，均匀涂布于氨苄平板上，37℃温箱中培养24h。

1.2.3.7鉴定阳性菌落

挑取多个单菌落，接种到3mL氨苄LB液体培养基的试管中，振摇培养过夜。

小量提取质粒，先于1.2%琼脂糖上电泳鉴定质粒的大小和浓度。

然后每个样品取出5μL用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切消化鉴定，双酶切体系为：

超纯水6μL、pET-VP210μL、10×KBuffer2μL、EcoRⅠ1μL、BamHⅠ1μL

混匀上述反应体系，37℃反应2~3h，酶切产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

阳性克隆命名为pET-VP2。

1.2.4BL21VP2诱导表达比较

1.2.4.1含阳性质粒的E.coli的诱导表达和样品处理

挑取含pET-VP2的BL21VP2平板上的单个菌落，过夜培养于37℃培养至OD6000.5~0.6之间，加入1mM终浓度的IPTG37℃诱导6h。

取样品菌液1mL，室温离心12000rmp1min，收集菌体。

加入2×上样缓冲液50μL和纯水50μL，吹打使混合均匀。

于沸水中水浴5min，每个样品均取20μL上样，于12%分离胶上进行SDS-PAGE。

1.2.4.2SDS-PAGE

参照《分子克隆实验指南》（第二版）[9]，在垂直板式聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行SDS-PAGE。

配制12%分离胶：

在一洗净的50mL小烧杯中，依次加入纯水3.4mL、30%丙烯酰胺贮存液4.0mL、Ph8.81.5MTris-HCL缓冲液2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.55mL和TEMED0.01mL，混匀。

加入TEMED后迅速将混合物沿玻璃板倒入槽内，使槽内液体的上液面距离短玻璃上缘约2~3cm，胶液表面小心加入纯水，用纯水慢慢冲洗2~3次，洗去未聚合的分离胶，然后用吸水纸吸去残余水，开始配制浓缩胶。

配制5%浓缩胶：

在另一洗净的50mL小烧杯中，依次加入纯水2.85mL、30%丙烯酰胺贮存液0.85mL，Ph6.80.5MTris-HCL缓冲液1.25mL、10%SDS0.05mL，10%过硫酸铵0.025mL和TEMED0.01mL。

轻旋烧杯以充分混匀，但勿摇起泡沫。

加入TEMED后迅速将混合物沿玻璃板倒入槽内，加满，插入预先洗净、烘干的梳子。

室温下放置一段时间，使凝胶充分形成。

加入Tris-甘氨酸缓冲液（1000mL中含Tris3.03g，甘氨酸14.1g，10%电泳级SDS10mL）约1000mL，倒入电泳槽中。

拔出梳子。

用加样器长针头整理各加样孔边缘。

每孔上样15~20μL，将电源负极接至矮板一侧电极，电源正极接至高板一侧电极，电压调至100V开始电泳，直到电泳结束。

当电泳进行至样品中恶溴酚蓝指示剂距凝胶下缘约1cm时，停止电泳，卸下玻璃板，取出凝胶，在考马斯亮蓝R-250染色液中染色5h，在脱色液中充分脱色。

2结果与分析

2.1VP2基因的PCR结果

取出PCR产物10μL于1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，并与MarkerDL2000对照，可见在约860bp处见到一特异、明显条带，即为VP2基因见图2。

211

图2水貂阿留申病毒VP2基因PCR产物电泳分析

1．VP2基因PCR的产物；

2．DL2000DNA分子量标准；

Fig.2theagarosegelanalysisofvp2gene

1．vp2genePCRProduct；

2．DL2000DNAMarker；

2,DL2000DNAMarker;

860bp

1000bp

750bp

2.2PT-VP2重组质粒的酶切鉴定

pGem-TEasy载体的大小为3Kb，插入的完整VP2基因为860bp。

在插入的外源基因的两侧有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，因此，用EcoRⅠ和BamHⅠ可切出外源片段。

酶切鉴定结果见图3。

112

T载体

860bp

1000bp

750bp

图3重组质粒PT-VP2酶切鉴定结果

1．阳性质粒;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定；

2．DL2000DNA分子量标准；

Fig.3IdentificationofrecombinantplasmidPT-VP2byrestrictionendonucleasedigestion

1．positiveplasmiddigestedbyEcoRIandBamHI；

2．DL2000DNAMarker；

2.3pET-VP2重组质粒的构建

pET-32a（+）空载体的大小为5900bp，插入的编码阿留申病毒VP2基因蛋白的基因为860bp。

按照设计，用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切即可切出外源片段见图4。

21

图4重组质粒pET-VP2酶切鉴定结果

1．阳性质粒;EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定；

2．DL2000DNA分子量标准；

Fig.4IdentificationofrecombinantplasmidpET-VP2byrestrictionendonucleasedigestion

1．positiveplasmiddigestedbyEcoRIandBamHI；

2．DL2000DNAMarker；

pET-32a

860bp

1000bp

750bp

2.4BL21VP2E.coli重组蛋白表达

经IPTG诱导表达，确定IPTG浓度为lmmol/L、诱导温度为37℃，从0h开始诱导，诱导5h，每1h取一次菌液，一次1mL。

SDS-PAGE分析表明，pET-VP2经诱导表达后，在2lkD处有明显的蛋白带，与预期的目的产物蛋白带大小一致，而未诱导菌没有出现相同的条带。

其大小与推测的一致见图5。

97.2KD

66.4KD

44.3KD

29.0KD

20.1KD

14.3KD

M12