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基因敲除技术

基因敲除技术研究进展综述

摘要：

基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域,如建立人类疾病的转基因动物模型（糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等）。

这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究:

研究发育过程中各个基因的功能,研究治疗人类遗传性疾病的途径。

关键字：

基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型

1．概述：

基因敲除又称为基因打靶,是指从分子水平上将一个基因去除或替代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。

是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。

基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿,并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响,成为革命性的研究工具,具有极其重要的理论意义和实践意义。

基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥•卡佩奇（MarioCapecchi）、82岁的美国人奥利弗•史密西斯（OliverSmithies）和66岁的英国人马丁•埃文斯（MartinEvans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。

2.基因敲出技术发展历史

80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。

关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。

Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。

该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。

2000年Shimizu等[于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。

该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。

2004年该实验室Cui[等又报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能，从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的时间精度，成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。

然而，长期以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能。

但我们知道，大鼠、家兔、猪以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类，大动物更有益于某些繁琐的手术操作，同时血浆及组织样本量较多，更有益于研究。

3.基因敲出的一般步骤：

利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：

ａ．ES细胞的获得：

现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。

c57BL／6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。

ｂ．基因载体的构建：

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如neo基因，TK基因等）的载体上，此重组载体即为打靶载体。

因基因打靶的目的不同，此载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。

如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体要包括外源基因（即目的基因）、同源基因片段及标记基因等部分。

如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体，应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。

ｃ．将基因打靶载体通过一定的方式（常用电穿孔法）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。

一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

ｄ．用选择性培养基筛选已击中的细胞：

一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。

将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

ｅ．通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

2．实现基因敲除的不同原理和方法：

2．1．利用基因同源重组进行基因敲除

基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：

a．基因载体的构建：

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如neo基因，TK基因等）的载体上，成为重组载体。

基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

b．ES细胞的获得：

现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

ｃ．同源重组：

将重组载体通过一定的方式（电穿孔法或显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

ｄ．选择筛选已击中的细胞：

由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率为10－4～10－5。

因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。

目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。

其中应用最多的是PNS法。

ｅ．表型研究：

通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

f．得到纯合体：

由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

2.1.2同源重组实现基因敲除的新进展：

2.1.2.1条件性基因敲除法

条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。

它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。

条件性敲除的原理：

利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。

通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP的（“loxPfloxed”）ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxPfloxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交（也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶），产生靶基因发生特定方式（如特定的组织特异性）修饰的条件性突变小鼠。

在“loxPfloxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxPnoxed”小鼠表型仍同野生型的一样。

但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxPfloxed”靶基因和Cre基因。

Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。

这样，靶基因的修饰（切除）是以Cre的表达为前提的。

Cre的表达特性决定了靶基因的修饰（切除）持性：

即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰（切除）就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。

所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

2.1.2.2诱导性基因敲除法

诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。

人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。

常见的几种诱导性类型如下：

四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。

诱导性基因敲除优点：

①诱导基因突变的时间可人为控制；

②可避免因基因突变而致死胎的问题

③在2个loxP位点之间的重组率较高；

④如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。

2.2利用随机插入突变进行基因敲除。

2.2.1原理：

此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。

逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。

插入了靶目标的基因转录翻译出无活性的目标蛋白随机插入内含子中需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白

2.2.2基因捕获法

基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法，其原理可见图6。

通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。

中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得

2.2.3基因捕获法的优缺点

用常规方法进行基因敲除研究需耗费大量的时间和人力，研究者必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，绘制相应的物理图谱，构建特异性的基因敲除载体以及筛选中靶ES细胞等，通常一个基因剔除纯合子小鼠的获得需要一年或更长的时间。

面对人类基因组计划产生出来的巨大的功能未知的遗传信息，传统的基因敲除方法显得有些力不从心。

因此，基因捕获法应运而生，利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。

此方法的缺点是只能剔除在Es细胞中表达的基因．单种的细胞类型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞

表达的基因，因此，在ES细胞中进行基因捕获还是大有可为的。

用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰，

2.3.RNAi引起的基因敲除。

由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。

近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。

2.3.1RNAi阻断基因表达的机理

双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面双链RNA还能在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA-directedRNApolymerase，RdRP）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。

SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。

此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。

结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。

这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。

从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

2.3.2RNAi基因敲除的优点及应用

①比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。

②对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。

③由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。

④RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。

2.3.2RNAi基因敲除的缺点

RNA干扰技术存在许多问题，使它不能完全替代基因敲除技术：

1.RNAi不适用于所有的细胞，而基因敲除技术则可以作用于个体胚胎发育各个介段，能精确地敲除任何组织或器官的目的基因；

2.RNAi在低等生物中能高效诱发基因沉默，但是在哺乳动物中，RNAi的抑制效果远远不如在低等生物体中那么明显，而基因敲除对哺乳动物的效果也是明显的；

3.基因敲除得到的动物模型具有遗传性，能够进行繁殖而获得大量的基因敲除动物群体，有利于实验的延续，而RNAi的基因沉默是没有遗传性的。

2.4实现基因敲除的其他原理。

除上述几种已经比较成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，还有一些基于其他原理的敲除技术正处于研究和完善过程中，如TFOs（Triplehelixformingoligonucleotides）引导的基因敲除术以及反义技术在基因敲除技术中的运用等。

随着遗传学，分子生物学理论的发展，新的基因敲除原理也在不断的发现和发掘中。

3．基因敲除技术的应用及前景：

①建立生物模型

基因敲除动物模型的建立，为研究人类疾病提供了一个崭新的方法，如：

通过敲除小鼠的OA1基因用来研究人类眼球白化症。

在药物依赖性研究中基因敲除技术也发挥了重要作用，利用基因敲除技术培育出了先天性缺失某一特定受体基因的动物用于研究该受体所发挥的作用，如：

通过基因敲除技术培育出阿片μ、δ、κ三种亚型受体基因缺陷小鼠用于研究吗啡产生的精神依赖性史由什么受体介导的。

在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。

基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。

这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。

最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。

②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗

在对罗格列酮对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响的实验中发现，罗格列酮可以抑制动脉粥样硬化病变的发展；2010年张风河等应用敲除技术研究p75神经营养蛋白受体及印尼敲除对小鼠面神经损伤后神经再生的影响，结果发现可以增强面神经的再生通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。

这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。

③提供廉价的异种移植器官

众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。

这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。

如：

PPLTherapeutics公司于1999年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT基因。

使每只猪都缺乏产生a１－３半乳糖基转移酶的基因的２个拷贝。

这些酶在细胞表面产生一种糖分子，人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性，从而引发超急性免疫排斥反应。

在缺乏这种酶的情况下，超急性排斥反应即不会再发生。

④免疫学中的应用

同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。

而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。

⑤改造生物、培育新的生物品种

作为一项新兴的微生物育种技术，基因敲除克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性，敲除后改变的基因会随染色体DNA进行复制，改良的菌种可以稳定地用于后续的研究和生产。

这样的方法具有很强的目的性，大大节省了为生物技术研究的时间。

细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。

它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。

4．基因敲除技术的缺陷

随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：

一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。

参考文献：

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