原创靶向MRP1基因pRNATH1461以及shuttleRFP重组质粒表达载体构建毕业论文.docx
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原创靶向MRP1基因pRNATH1461以及shuttleRFP重组质粒表达载体构建毕业论文
齐齐哈尔大学
毕业设计（论文）
题目靶向MRP1基因pRNAT-H1.1shuttle-RFP重组质
粒表达载体构建
学院
专业班级
学生姓名
指导教师
成绩
2011年6月20日
摘要
癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。
化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。
肿瘤细胞的多药耐药性（multidrugresistance,MDR）是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。
肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1（MultidrugResistance-associatedProtein1，MRP1）的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。
RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。
目的：
本课题选用pRNAT-H1.1shuttle-RFP表达穿梭载体。
构建针对mrp1mRNA的RNA干扰表达载体。
方法：
将预先根据MRP1基因序列设计合成的编码siRNA的cDNA序列与pRNAT-H1.1shuttle-RFP质粒载体连接，构建靶向mrp1siRNA重组质粒。
将重组质粒转化E.coliDH5α后大量提取重组质粒，经菌落PCR和DNA测序分析检测重组载体构建结果。
结果：
成功构建靶向MRP1基因pRNAT-H1.1shuttle-RFP重组质粒表达载体。
为下一步抑制mrp1基因在肿瘤细胞中的表达奠定基础。
关键词：
RNA干扰；MRP1；pRNAT-H1.1shuttle-RFP质粒；穿梭载体
Abstract
Cancer,aseriousthreattotherisingtrend.Chemotherapyastheroutineclinicaltherapyoftumor,whichisanirreplaceablewayincancertreatment.MDRoftumorcellcausethefailureofchemotherapytreatment.ThereasoncausingthecancerMDRisrelativelycomplicated,andtheexcessivelyexpressionofmultidrugresistance-associatedprotein1（MRP1）isoneofthereasonscausingMDR.SilencingMDR1genebyRNAi,wecanimprovetheeffectofchemotherapybydecreasethelevelofMDR.
Objective:
Inthisstudy,pRNAT-H1.1shuttle-RFPplasmidwasselectedtoconstructtheRNAiexpressionvectorofmrp1mRNA.
Methods:
Accordingtomrp1wedesignedandsynthesizedtheDNAfragmentthatwasclonedintopRNAT-H1.1shuttle-RFPvectortoconstructrecombinantvector.TransformedtherecombinantvectorintoE.coliDH5α.TheresultofrecombinantvectorwasanalyzedandidentifiedusingPCRandDNAsequencing.
Results:
ConstructingpRNAT-H1.1shuttle-RFPrecombinantplasmidexpressionvectorwasconstructedsuccessfully.ItmaybethefoundationofrestraintheexpressionofMRP1geneincancercells.
KeyWords：
RNAinterference；MRP1；pRNAT-H1.1shuttle-RFPplasmid；shuttlevector
目录
摘要I
AbstractII
第1章绪论1
1.1RNAi的研究进展1
1.1.1RNAi的发现过程1
1.1.2RNAi的分子作用机制2
1.1.3RNAi的特点3
1.1.4siRNA简介3
1.1.5siRNA的设计原则3
1.1.6RNAi在抗肿瘤方面的研究4
1.2用于RNAi的载体4
1.2.1载体的选择5
1.2.2质粒人工构建的目的5
1.3MRP1的研究进展5
1.3.1MRP的转运底物、组织分布及生理作用6
1.3.2MRP在组织中的表达6
1.4基因治疗7
1.5本课题在国内外的研究现状7
1.6本论文的研究目的及意义8
1.7本论文的主要内容8
第2章实验材料与方法9
2.1实验材料9
2.1.1宿主菌9
2.1.2质粒载体9
2.1.3载体通用引物11
2.1.4主要试剂及工具酶11
2.1.5主要仪器12
2.2实验方法13
2.2.1shRNA的设计与退火13
2.2.2合成干涉片段的退火16
2.2.3重组载体的构建17
2.2.4菌落PCR初步筛选阳性重组子20
2.2.5测序鉴定重组载体21
2.2.6重组质粒大提的OD值检测21
第3章结果与分析22
3.1质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后胶回收结果22
3.1.1质粒经HindⅢ和BamHI双酶切后结果22
3.1.2目的片段的回收23
3.2重组载体的菌落PCR24
3.3重组质粒大量提取25
3.4重组质粒测序结果26
讨论29
4.1菌落PCR鉴定重组29
4.2重组质粒穿梭载体的构建29
结论30
参考文献31
致谢34
第1章绪论
1.1RNAi的研究进展
RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程，是一项新兴的基因阻断技术。
RNAi有望成为分析人类基因组功能的有力工具，在肿瘤病因、免疫机制及治疗等方面的研究上有广阔的发展前景。
1.1.1RNAi的发现过程
1990年，RichJorgensan和他的同事在对矮牵牛花进行实验时，无意中发现一种奇怪的现象。
他们尝试把pigment-produing这种由强有力的启动子控制的基因导入矮牵牛花以加深花的紫色，结果却发现不但颜色未加深，许多花呈现杂色甚至白色。
RichJorgensan把这种现象称为共同抑制，因为导入了外源性基因，使得和内源性基因具有相似功能的基因的表达都被抑制了[1]。
遗憾的是当时这种现象并未引起Jorgensen的重视。
1994年，Cogoni[2]和Macino采用粗糙脉胞霉进行转基因研究时，发现真菌中也存在类似的现象，他们称之为基因抑制，这一现象后来在其它真菌中也相继被发现。
1995年Guo[3]等在对线虫的实验中发现，正义RNA与反义RNA一样可以阻断par21基因的表达，可惜作者同样对这一现象也没有更深入的研究，只做了普通的报道。
直到1998年，关于RNAi现象的研究才被人们真正的发现[4]。
Fire[5]等将双链RNA，即正义链和反义链的混合物，注射到线虫的体内，却诱发了比正义链或反义链的单独注射效果更强的基因沉默，要彻底使同源基因的表达沉默，在每一个细胞中，只需要很少的几个分子的双链就可以做到。
在接下来进行的实验中还证实[6]，将双链RNA注入线虫体内后，不但阻断了线虫体内所有同源基因的表达，同时还沉默了其第1代子代的同源基因，他们从此把这种现象命名为RNAi。
随后，RNAi现象又陆续在果蝇、锥形虫、真菌、涡虫、植物及斑马鱼等真核生物的研究中被发现[7]。
这种情况揭示了RNAi现象可能出现于生命进化的早期阶段，在RNAi机制发现之前，不同生物中的RNAi现象有着不同的描述：
真菌中称为“镇压”作用，在植物中被称为转录后基因沉默和基因协同抑制[8]。
1.1.2RNAi的分子作用机制
RNAi的作用机制在众多学者的努力研究下日渐明朗。
不同生物体内的RNA干扰作用机制也各有不同，但是主要可以分为两种类型：
特异效应作用机制与非特异效应作用机制。
特异性效应一般发生在短双链RNA（21～23nt）上，非特异性效应发生于长双链RNA（30nt以上）。
[9]。
其中，RNAi的特异效应作用机制是在多个不同的水平上实现的，包括翻译水平、转录水平、转录后水平等。
其中，转录后水平RNA干扰的研究最为深入，应用也最为广泛。
[10]
1.1.2.1特异性效应
转录后水平的RNA干扰的发生机制是在对果蝇、线虫等生物体进行科学研究从而进一步推导得出来的。
随着科学技术的发展和RNAi研究的深入，人们对RNAi的作用机制的了解也越来越多，通过生化和遗传学研究，现在普遍认为RNAi可能的作用机制主要包括两个阶段：
第一步：
起始阶段，即内源或外源dsRNA经特定的RNaseIII家族的双链特异的核糖核酸酶（Dicer）以ATP依赖的方式将长的dsRNA切割成21～23nt的小干扰RNA；第二步，效应阶段，即siRNA与RNA诱导沉默复合物RISC结合共同降解靶mRNA[11]。
除此之外还有某些研究认为RNAi的作用机制还存在着第三阶段——循环放大阶段。
这是RNAi的自身循环放大机制，其机制主要是指在效应阶段，RISC活化后与mRNA结合，mRNA被内切核酸酶切割成大小在l2～23nt不等的小片段，这些片段可以特异性地阻碍表达靶基因。
同时，释放出来一种可以作为特殊引物的siRNA，从而以靶mRNA为模板在RdRP的作用下，合成新的dsRNA。
这种dsRNA可以降解成新的siRNA，在这个循环中表现出放大效应[10]。
抑制相应mRNA的翻译可阻碍相应的蛋白质表达，这就是翻译水平的RNA干扰机制[12]，其中stRNA起到了非常的重要作用。
转录水平上的RNA机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用，从而加强同源DNA的甲基化，以阻碍目的基因转录，使表达关闭，从而强化基因沉默。
有文献谈到组蛋白H3及相应DNA区域可被dsRNA诱导甲基化。
一旦启动子区域出现甲基化，那么转录将被阻断，如编码区出现甲基化，则可以进行转录，但在转录后水平上沉默。
1.1.2.2非特异效应
研究表明，长度大于30nt的长双链RNA转染至哺乳动物体内，dsRNA会激活双链RNA所依赖的蛋白激酶途径[13]，从而导致EIF-2α因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，诱发全面的细胞基因沉默。
1.1.3RNAi的特点
RNAi具有高效性，也就是说与细胞内的mRNA的量相比，注入细胞内的siRNA的量要少得多。
但由于循环放大机制的存在，仍可以有效地阻断目的基因的表达；同时，RNAi也具有高特异性，小干扰RNA由dsRNA降解得到的，除在序列识别中不起主要作用的正义链3′端的两个碱基以外，其余碱基均为必需。
任何单个碱基的改变即导致RNAi失效，RNAi能特异性降解mRNA，针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活。
除此之外，RNAi还具有共抑制性、种属时效性和dsRNA的长度限制性的特点。
1.1.4siRNA简介
RNA干扰作用是通过siRNA（smallinterferingRNA，siRNA）这类小RNA分子作为较稳定的中间介质实现的。
通过对植物的研究证明，双链RNA复合体降解为35nt左右的小RNA分子后通过序列互补与mRNA结合，进而降解mRNA。
RNaseIII核酶家族的Dicer是RNA干扰中一个非常重要的酶。
它可以结合到dsRNA上，并剪切其成为21～23nt且3'端突出的小分子RNA片断，形成siRNA。
[14]
1.1.5siRNA的设计原则
RNAi作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构，不同结构的siRNA序列沉默基因的效率差别很大，2001年，ElbashirSM等[15]应用化学合成法合成了siRNA，并发现可以诱导哺乳动物发生RNAi，他们进而据此提出了siRNA设计方法：
1）从起始密码下游50~100nt开始搜索siRNA以避免出现于5′或3′端的UTRs的蛋白结合位点，；2）搜索5′AA（N19）UU序列，如果没有相应序列，可以选择5′AA（N21）或5′NA（N21）；3）GC含量在32%~79%之间[16]；4）要确定siRNA对靶基因的特异性，可以利用Blast软件在基因组中进行比对，；5）设置在基因组中无对应序列的siRNA的对照siRNA。
但是，ElbashirSM等的设计方法siRNA筛选效率仍然很低，要更好的掌握RNAi，提高效率，理性设计siRNA有效序列成为siRNA研究的重要方向。
目前,影响siRNA功能的因素包括siRNA序列的结构特点，靶mRNA的空间结构RISC与siRNA的相互作用，以及siRNA与mRNA错配等[17]。
1.1.6RNAi在抗肿瘤方面的研究
目前对肿瘤的治疗手段主要有药物化学治疗、手术切除和放射治疗，这些治疗方法均无法做到特异性地杀伤及完全根除肿瘤，而且副作用较大。
RNAi具有特异性、简易性及高效性的特点，可稳定沉默突变基因，而对正常基因的表达不产生影响，在肿瘤的研究及治疗上有着无法比拟的优势。
随着RNAi技术的不断成熟，肿瘤的研究有了空前突破，研究的重点主要在有关肿瘤免疫逃逸、肿瘤性疾病信号传导的途径、癌基因及抑癌基因的敲除、提高肿瘤对化疗及放疗的敏感性等方面[18]。
1.2用于RNAi的载体
基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，称为载体。
是指能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。
载体具有以下的功能：
（1）运送外源基因高效转入受体细胞；
（2）为外源基因提供复制能力或整合能力；
（3）为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
目前使用的已知载体除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母、细菌人工染色体载体以及动、植物病毒载体等[19]
作为基因工程中使用的载体必须具备以下条件：
（1）有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；
（2）具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；
（3）具有筛选转化子的选择性标记基因；
（4）分子量小，拷贝数多；
（5）具有较高的外源DNA的载装能力；
（6）安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。
载体按其应用范围，可以分为克隆载体和表达载体。
克隆载体是指用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。
一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。
表达载体是指使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。
可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。
1.2.1载体的选择
质粒是为一种1-200kb不等的双链、闭环的DNA分子。
是染色体外稳定遗传，并能以超螺旋状态存在于宿主细胞中的因子。
RNA干扰实验通常选用质粒作为载体。
质粒载体是为适应实验室操作在天然质粒的基础上人工构建的。
构建的质粒载体与天然质粒相比通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因），同时可能带有多个人工合成的单一限制性内切酶识别位点。
但是，天然质粒的缺点是分子量大，拷贝数低，所以为使分子量尽可能减少，必须去掉大部分的非必需序列，以便于基因工程操作。
[20]除此之外，质粒载体一般还带有一些可以进行体外转录外源DNA、鉴定片段的插入方向等用途的序列。
[21]
细菌质粒是独立于细菌染色体的自主复制的环状双链DNA分子，只有酵母的杀伤质粒已知是RNA分子。
环状双链DNA分子有三种构型。
包括两条链的环状结构都保持完整的呈超螺旋构型的共价闭合环状DNA（cccDNA），双链中有一条链环状结构完整，只在另一条单链上有切口的开环DNA（ocDNA）以及双链断裂呈线状的线状DNA[22]。
在琼脂糖凝胶电泳时，同种质粒的三种构型迁移速率各不相同，超螺旋构型的共价闭合环状DNA走得最快，其次是线状DNA，最慢的是开环DNA。
1.2.2质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：
（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择
（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组
（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量
（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝
（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
1.3MRP1的研究进展
在1992年多药耐药相关蛋白1（MRP1又被称为ABCC1）的识别以及它的起始特征阐明了这种蛋白确实代表了一种选择性药物泵。
编码MRP1的cDNA第一次克隆是通过从阿霉素-选择性的多药耐药人肿瘤细胞系（H69R）中筛选差异cDNA得到的。
MRP1基因（ABCC1）位于染色体16p13.1上并且编码含有1531个氨基酸的蛋白。
经序列分析，将MRP1分为ATP-结合框超家族中的一员，MDRP-糖蛋白也属于这一超家族。
MRP1是一个膜整合糖磷蛋白，其表观分子量为190kDa[23,24]，一个运用ATP结合水解[25,26]产生的能量，来行使此蛋白主要的有活性的转运功能。
1.3.1MRP的转运底物、组织分布及生理作用
MRP1的底物直接通过细胞毒性分析和底物刺激的ATP酶测量进行识别MRP1的底物的，底物是由大量的多样化的疏水复合物，有机阴离子结合物以及阴离子非结合性底物所组成。
典型的结合型底物包括：
谷胱甘肽，葡糖醛酸和硫酸盐结合物，
MRP1的组织分布MRP1在体内的表达可以说是无所不在。
MRP1表达水平最高的组织包括：
肺，睾丸，肾，心和胎盘；
MRP1的生理作用MRP1在作为机体主要防线的组织中分布，以及MRP1的底物特异性，表明MRP1有保护机体免受外源生物质和内源毒性代谢物侵害的生理作用。
通过对基因敲除的动物进行研究确定了MRP1的功能。
尽管很多体外实验明确的证实了：
MRP1介导外源和内源物质的转运。
但是几次尝试证实MRP1在体内的保护作用都没有成功。
1.3.2MRP在组织中的表达
典型的MDR机制在肿瘤耐药中起一定作用，但多数学者发现MDR1基因和P-gP在肿瘤中的表达水平并不高，难以解释NSCIC的高度耐药。
Narasaki等发现许多癌组织同时表达MRP1和MDR1，但后者表达较低，故认为MRP1较MDR1能是反映肿瘤多药耐药更好的指标。
在肿瘤复杂的耐药机制中，MRP1和MRP3的过度表达发挥了重要作用。
Oguri等报道在运用铂类化疗药物后，40例肿瘤患者的MRP5表达较用药前明显增高，且伴有MRP1及GSH的升高，故认为MRP5可能与GSH一起参与MRP1导的多药耐药[27]。
1.4基因治疗
基因治疗是肿瘤多药耐药逆转的手段之一，所谓基因治疗是指利用遗传或分子生物学方法将外源基因导人生物体内或人体细胞内，以弥补所缺失的基因或关闭、降低异常基因的表达，从而对疾病进行治疗。
基因治疗是治疗肿瘤的新手段，目前共有3种MDR基因治疗的策略：
将相关凋亡基因转导入肿瘤细胞，促使其凋亡；使用反义技术抑制肿瘤细胞耐药基因表达；将外源mdr1基因转导入人造血干细胞以提高骨髓对化疗药物的耐药性。
1.5本课题在国内外的研究现状
多药耐药蛋白基因1编码的多药耐药蛋白的过度表达是重要的肿瘤耐药机制之一。
RNAi是一种用dsRNA作为序列特异性的触发器指导同源单链RNA降解的细胞机制。
在最近的研究中显示特定目的基因的表达可被RNA干扰高效抑制。
小干扰RNA（siRNA）作为一种中间介质，介导哺乳动物细胞中与之同源基因的沉默[28]。
RNAi的作为一种经济、快捷、高效的技术手段，正逐步被应用于遗传性疾病、病毒性疾病以及肿瘤等的基因治疗。
从1990年，植物学家对矮牵牛花注入红色素基因，却使花变成白色，到1995年SuGuo博士利用线虫完成的实验，科学家首次发现了RNA干扰的现象，但是并未能对其理论做出合理解释。
直到1998年，AndrewFire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，AndrewFire和CraigMello将这一现象命名为RNAi，并于1998年在Nature上发表了相关论文。
随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于果蝇，线虫，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNA干扰来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。
近几年来RNAi的研究取得了很大进展,2001年它被《Science》杂志评为十大科学成就之一,2002年被评为十大科学成就之首。
[29]自2002年5月以后，先后出现将RNAi技术应用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美国科学家McCaffrey）和癌细胞（如我国徐根兴教授）的研究报道。
这一发现提示可以应用RNAi技术来抑制MRP1基因的蛋白表达。
NiethC等（2003）发现临床上化学合成siRNA更适于联合治疗，可以利用化学合成的siRNA同时转录多种MRP相关基因，如其他ABC转运编码基因或细胞凋亡编码基因等，而且也可同时编码其他致癌基因或血管生成因子进行联合治疗2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家，以表彰他们发现了RNA干扰现象。
由于RNAi技术的高效性和高度特异性，RNAi已成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段，并为基因治疗开辟了新的途径。
现RNAi已广泛应用到HIV、病毒性肝炎、基因治疗及药物筛选探索中，对肿瘤细胞多药耐药性干扰作用的研究也正在迅速发展中，随着研究的深入和发展，将为MRP细胞的逆转提供一个安全有效的途径。
1.6本论文的研究目的及意义
癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。
化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。
肿瘤细胞的多药耐药性是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。
肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。
RNA干扰是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过RNAi技术沉默MDR1基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。
本实验针对mrp1基因设计并合成了两对能编码siRNA的DNA片段，进而构建pRNAT-H1.1shuttle-RFP重组质粒表达穿梭载体，为研究以RN
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