总大肠菌的测定实验作业指导书.docx
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总大肠菌的测定实验作业指导书
作业指导书
页码：
第1页，共11页
文件编号：
JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
文件名称：
水中总大肠菌群的测定
发布日期：
2016年1月1日
水中总大肠菌群的测定
1、方法依据
水质水中总大肠菌群的测定多管发酵法
2、适用范围
总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。
主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。
如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：
所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。
但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
作业指导书
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第2页，共11页
文件编号：
JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
文件名称：
水中总大肠菌群的测定
发布日期：
2016年1月1日
3、测定原理
3.1水中总大肠菌群的测定
多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
4、试剂
4.1乳糖蛋白胨培养液:
蛋白胨10g
牛肉浸膏3g
氯化钠5g
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第3页，共11页
文件编号：
JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
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水中总大肠菌群的测定
发布日期：
2016年1月1日
乳糖5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml
蒸馏水100ml
将蛋白胨、酒肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，与高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
4.2三倍乳糖蛋白胨培养液：
与4.1的配置方法相同，将乳糖蛋白胨培养液浓缩3倍配置。
4.3品红亚硫酸钠培养基：
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾3.5g
琼脂20～30g
蒸馏水1000ml
无水硫酸钠5g左右
5%碱性品红乙醇溶液20ml
4.3.1贮备培养基：
先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使其溶解，再加以蒸馏水补足至
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JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
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水中总大肠菌群的测定
发布日期：
2016年1月1日
1000ml，调整pH为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，在加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶中，置高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min。
贮存于冷暗处备用。
4.3.2平板培养基：
将上述贮备培养基加热融化。
以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1:
50的比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液致于灭菌空试管中；再按1:
200的比例称取所需要的无水硫酸钠置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，品红乙醇溶液内置深红色褪成淡红色为止。
将此种混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀。
立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。
此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
4.4伊红美蓝培养基
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2.0g
琼脂20g
蒸馏水100ml
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JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
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水中总大肠菌群的测定
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2016年1月1日
2%伊红水溶液20ml
0.5%美蓝水溶液13ml
4.4.1贮备培养基：
先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热融化，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH为7.2～7.4。
趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，在加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶中，置高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min。
贮存于冷暗处备用。
4.4.2平板培养基的配置：
将上述贮备培养基加热融化。
以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及0.5%美蓝水溶液加入已融化的贮备培养基中，并充分混匀。
当混好的培养基冷至45℃，便立即适量倾倒入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置与冰箱备用。
5、步骤
5.1生活饮用水
5.1.1初发酵试管：
在两个装有已灭菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中，以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的试管中，以无菌操作加入充分混匀的水样10ml，混匀后置于37℃恒温箱培养
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JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
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水中总大肠菌群的测定
发布日期：
2016年1月1日
24h。
5.1.2平板分离：
经初发酵试管培养24h后，发酵试管颜色变为黄色为产酸，小玻璃倒管内有气泡为产气。
将产酸产气及只产酸发酵管，分别用接种环划线接种于品红硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，置37℃恒温箱内培养18～24,挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。
品红亚硫酸钠培养基上的菌落：
紫红色，具有金属光泽的菌落；
深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
淡红色，中心色较深的菌落。
伊红美蓝培养基上的菌落：
深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
淡紫红色，中心色较深的菌落。
5.1.3复发酵试验：
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养
液中（内有倒管），每管可接种分离自同一出发酵管（瓶）的最典型菌落1~3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群菌存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）
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JLQX-03-022
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2016版，第0次修订
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水中总大肠菌群的测定
发布日期：
2016年1月1日
数查表5-2-9，报告每升水样中的大肠菌群数。
5.2水源水
5.2.1将水样做1:
10稀释。
5.2.2于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的五个试管中，各加10ml水样；于各装有10ml蛋白胨培养液的五个试管中，各加1ml水样；于各装有10ml蛋白胨培养液的五个试管中，各加入1ml1:
10稀释水样。
共计15个管，三个稀释度，将各管充分混匀，置于37℃恒温箱培养24h。
5.2.3平板分离和复发酵试验的检验步骤同5.1的“生活饮用水”检验方法。
5.2.4根据证实总大肠菌群存在的阳性管数查表5—2—10，即求得每100ml水样中存在的总大肠菌群数。
5.3地表水和废水
5.3.1地表水中较清洁的初发酵试验步骤同5.2的饮用水源水方法。
有严重污染的地表水和废水初发酵试验的接种水样应做1:
10,1:
100,1;1000或更高的稀释，检验步骤同5.2的饮用水源水方法。
5.3.2如果接种的水样量不是10ml，1ml，0.1ml，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，在经下面的公式换算
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JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
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水中总大肠菌群的测定
发布日期：
2016年1月1日
成每100ml的MPN值。
我国目前以1L为报告单位，MPN值在乘10，即为1L水样中的大肠杆菌。
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JLQX-03-022
版次：
2016版，第0次修订
文件名称：
游离氯和总氯的测定
发布日期：
2016年1月1日
表5-2-9大肠菌群检数表
（接种水样100ml2份，10ml10份总量300ml）
10ml水量的
阳性管数
100ml水量的阳性瓶数
0
1
2
1L水样中大肠菌群数
1L水样中大肠菌群数
1L水样中大肠菌群数
0
＜3
4
11
1
3
8
18
2
7
13
27
3
11
18
38
4
14
24
52
5
18
30
70
6
22
36
92
7
27
43
120
8
31
51
161
9
36
60
230
10
40
69
＞230
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JLQX-03-022
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2016版，第0次修订
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游离氯和总氯的测定
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2016年1月1日
表5-2-10最可能数（MPN）表
出现阳性份数
100ml水样中细菌数的最可能数
95%置信限值
出现阳性份数
100ml水样细菌数的最可能数
95%置信限值
下
限
上
限
10
ml
1ml
0.1
ml
下限
上限
0
0
0
＜2
4
2
1
26
9
78
0
0
1
2
＜0.5
7
4
3
0
27
9
80
0
1
0
2
＜0.5
7
4
3
1
33
11
93
0
2
0
4
＜0.5
11
4
4
0
34
12
93
1
0
0
2
＜0.5
7
5
0
0
23
7
70
1
0
1
4
＜0.5
11
5
0
1
34
11
89
1
1
0
4
＜0.5
11
5
0
2
43
15
110
1
1
1
6
＜0.5
15
5
1
0
33
11
93
1
2
0
6
＜0.5
15
5
1
1
46
16
120
2
0
0
5
＜0.5
13
5
1
2
63
21
150
2
1
1
7
1
17
5
2
0
49
17
130
2
0
0
7
1
17
5
2
1
70
23
270
2
1
1
9
2
21
5
2
2
94
28
220
2
0
0
9
2
21
5
3
0
79
25
190
2
0
0
12
3
28
5
3
1
110
31
250
3
0
0
8
1
19
5
3
2
140
37
310
3
0
1
11
2
25
5
3
3
180
44
500
3
1
0
11
2
25
5
4
0
130
35
300
3
1
1
14
4
34
5
4
1
170
43
190
3
2
0
14
4
34
5
4
2
220
57
700
3
2
1
17
5
46
5
4
3
280
90
850
3
3
0
17
5
46
5
4
4
350
120
1000
4
0
0
13
3
31
5
5
0
240
68
750
4
0
1
17
5
46
5
5
1
350
120
1000
4
1
0
17
5
46
5
5
2
540
180
1400
4
1
1
21
7
63
5
5
3
920
300
3200
4
1
2
26
9
78
5
5
4
1600
640
5800
4
2
0
22
7
67
5
5
5
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