总大肠菌的测定实验作业指导书.docx

1、总大肠菌的测定实验作业指导书作业指导书页码：第 1页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质 水中总大肠菌群的测定 多管发酵法 2、适用范围 总大肠菌群是指那些能在3748h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。 总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。 如果是使用滤膜法，则总

2、大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于3724h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。作业指导书页码：第2页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸

3、产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。4、试剂4.1 乳糖蛋白胨培养液: 蛋白胨 10g 牛肉浸膏 3g氯化钠

4、5g作业指导书页码：第 3页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日 乳糖 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 蒸馏水 100ml将蛋白胨、酒肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，与高压蒸汽灭菌器中，在115灭菌20min，贮存于暗处备用。4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：与4.1的配置方法相同，将乳糖蛋白胨培养液浓缩3倍配置。4.3 品红亚硫酸钠培养基： 蛋白胨 10g 乳糖 1

5、0g 磷酸氢二钾 3.5g 琼脂 2030g蒸馏水 1000ml 无水硫酸钠 5g左右5%碱性品红乙醇溶液 20ml4.3.1 贮备培养基：先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾 及蛋白胨，混匀使其溶解，再加以蒸馏水补足至作业指导书页码：第 4页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日1000ml，调整pH为7.27.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，在加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶中，置高压蒸汽灭菌器中，在115灭菌20min。贮存于冷暗处备用。4.3.2 平板培养基：将上述贮备

6、培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1:50的比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液致于灭菌空试管中；再按1:200的比例称取所需要的无水硫酸钠 置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，品红乙醇溶液内置深红色褪成淡红色为止。将此种混合液全部加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀。立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。4.4 伊红美蓝培养基 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2.0g 琼脂 20g 蒸馏水 100ml作业指导书页码：第 5页，

7、共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日 2%伊红水溶液 20ml 0.5%美蓝水溶液 13ml4.4.1 贮备培养基：先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热融化，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨 ，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH为7.27.4。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，在加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶中，置高压蒸汽灭菌器中，在115灭菌20min。贮存于冷暗处备用。4.4.2 平板培养基的配置：将上述贮备培养基加热融化。以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管吸取一定量已灭菌的2%

8、伊红水溶液及0.5%美蓝水溶液加入已融化的贮备培养基中，并充分混匀。当混好的培养基冷至45，便立即适量倾倒入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置与冰箱备用。5、步骤5.1 生活饮用水5.1.1 初发酵试管：在两个装有已灭菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中，以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的试管中，以无菌操作加入充分混匀的水样10ml，混匀后置于37恒温箱培养作业指导书页码：第 6页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日24h。

9、5.1.2 平板分离：经初发酵试管培养24h后，发酵试管颜色变为黄色为产酸，小玻璃倒管内有气泡为产气。将产酸产气及只产酸发酵管，分别用接种环划线接种于品红硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，置37恒温箱内培养1824,挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。 品红亚硫酸钠培养基上的菌落： 紫红色，具有金属光泽的菌落； 深红色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡红色，中心色较深的菌落。 伊红美蓝培养基上的菌落： 深紫黑色，具有金属光泽的菌落； 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡紫红色，中心色较深的菌落。5.1.3复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞的杆菌，则

10、挑选该菌落的另一部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一出发酵管（瓶）的最典型菌落13个，然后置于37恒温箱中培养24h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群菌存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）作业指导书页码：第7页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日数查表5-2-9，报告每升水样中的大肠菌群数。5.2 水源水5.2.1 将水样做1:10稀释。5.2.2 于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的五个试管中，各加10ml水样；于各装有10ml蛋白胨培养液的五个试管中，

11、各加1ml水样；于各装有10ml蛋白胨培养液的五个试管中，各加入1ml1:10稀释水样。共计15个管，三个稀释度，将各管充分混匀，置于37恒温箱培养24h。5.2.3 平板分离和复发酵试验的检验步骤同5.1的“生活饮用水”检验方法。5.2.4 根据证实总大肠菌群存在的阳性管数查表5210，即求得每100ml水样中存在的总大肠菌群数。5.3 地表水和废水5.3.1 地表水中较清洁的初发酵试验步骤同5.2的饮用水源水方法。有严重污染的地表水和废水初发酵试验的接种水样应做1:10,1:100,1;1000或更高的稀释，检验步骤同5.2的饮用水源水方法。5.3.2 如果接种的水样量不是10ml，1ml

12、，0.1ml，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，在经下面的公式换算作业指导书页码：第 8页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：水中总大肠菌群的测定发布日期：2016 年1 月1 日成每100ml的MPN值。 我国目前以1L为报告单位，MPN值在乘10，即为1L水样中的大肠杆菌。作业指导书页码：第 9页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：游离氯和总氯的测定发布日期：2016 年1 月1 日 表5-2-9 大肠菌群检数表 （接种水样100ml 2份，10ml 10份 总量300ml）10

13、ml水量的阳性管数 100ml水量的阳性瓶数0121L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230作业指导书页码：第10页，共11页文件编号：JLQX-03-022版次：2016版，第0次修订文件名称：游离氯和总氯的测定发布日期：2016 年1 月1 日 表5-2-10 最可能数（MPN）表出现阳性份数100ml水样中细菌数的最可能数95%置信限值出现阳性份数100ml水样细菌数的最可能数95%置信限 值下限上限10ml1ml0.

14、1ml下限上限00024212697800120.574302798001020.5743133119302040.51144034129310020.575002377010140.51150134118911040.511502431511011160.51551033119312060.515511461612020050.51351263211502117117520491713020071175217023270211922152294282202009221530792519020012328531110312503008119532140373103011122553318044500310112255401303530031114434541170431903201443454222057700321175465432809085033017546544350120100040013331550240687504011754655135012010004101754655254018014004112176355392030032004122697855416006405800420227675552400