华南型黄瓜遗传多样性分析及雌性系转育.docx
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华南型黄瓜遗传多样性分析及雌性系转育
华南型黄瓜遗传多样性分析及雌性系转育
项目可行性报告
一、立项的背景和意义
黄瓜（CucumissativusL.）是葫芦科黄瓜属中的一种重要作物，原产温暖湿润的喜马拉雅山南麓和印度北部地区，是世界十大蔬菜作物之一和遗传研究模式作物，也是我国主要蔬菜作物之一。
由于不同地理区域自然生境、栽培条件、饮食习惯的差异，在栽培选择和利用过程中，品种发生分化，黄瓜形成了较多类型和品种。
目前，我国种植的黄瓜主要有华南型、华北型和欧洲温室型三大类。
华南型黄瓜瓜形肥短、皮光滑无刺、肉质较软，在我国长江以南有广泛分布。
逶传变异既是生物生存和适应的基础，也是物种发生、选择和进化的基础。
遗传多样性（geneticdiversity）是生物多样性的基本部分，是生态多样性和物种多样性的基础。
它通常被认为是种内不同群体之间或一个群体内不同个体间遗传变异的总和。
一个物种或群体遗传多样性越大或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强。
目前，在杂种一代亲本的选配中，越来越向综合性状符合育种目标、配合力高的少数材料上集中，这种长期的定向遗传改良引起植物遗传多样性的替代和丧失，随之而来的是物种和遗传多样性的减少和一致性的增强。
近年来，品种的选育和杂优化不仅使黄瓜自然资源的多样性受到侵蚀，而且使栽培品种的遗传背景愈显狭窄,遗传基础变得脆弱，抵御自然病虫害与逆境能力下降，严重妨碍了黄瓜品种的选育和生产水平的提高。
近年来在杂交一代品种的选育中，雌性系的研究和利用一直备受青睐。
黄瓜是雌雄同株异花植物，花为单性花或完全花，植株性别表达较复杂，最常见的是雌雄同株系（雌、雄花均有，且雄多雌少）。
雌性系通常包含全部为纯雌株的纯雌系和全部或大部分为强雌株小部分为纯雌株的强雌株系，在育种实践中有很大的利用价值，尤其是产量、早熟性、抗病性方面杂种优势的利用。
雌性系中的纯雌系指100％的雌花率，而对强雌系则未有明确指标界定，一般在80％以上或植株基部只有1~3朵雄花。
遗传资源是育种的物质基础和材料前提，因此，必须重视资源的搜集、保存、评价和利用，为育种源源不断地提供新的基因源。
我国华南型黄瓜种质资源丰富，但与华北型黄瓜相比，华南型黄瓜种质资源研究利用还不充分。
为此，本项目对已搜集到的华南型黄瓜种质资源进行形态标记聚类分析，并辅之分子标记技术，研究其遗传多样性。
同时，通过性别鉴定、自交分离和回交转育，加快雌性基因在华南型黄瓜优良地方品种上的研究和应用，以充分了解华南型黄瓜种质资源的遗传背景、系统分类和亲缘关系，分析其地理分布和自然生态型，为现阶段黄瓜育种实践中减少配制杂交组合的盲目性，改良亲本和选配强优势杂交种，有效划分杂交优势群，提高品种质量及育种效率提供一定依据。
二、国内外研究现状和发展趋势
植物的遗传多样性主要是通过遗传标记的多态性来反映的。
理想的遗传标记应具备以下特点：
①具有较强的多态性和稳定性，②表现为共显性，③对主要的农艺性状无不良影响，④简单易行、经济可靠。
遗传多样性的检测是目前遗传多样性研究的一个核心问题，其可在形态学、细胞学、同工酶和DNA不同水平上进行。
任何一种遗传多样性的检测方法都存在优点和局限。
形态学标记是指植物的外部特征特性，主要是检测不易受环境影响、遗传力较高和易于鉴定的表型性状，是最直接、简便易行的方法。
至今，形态学标记仍然是植物种以上或种内分类的重要依据之一。
在多聚酶链式反应基础上发展起来的RAPD、ISSR等技术，以操作简单方便、DNA用量少、速度快、周期短和安全见长，现已被广泛应用于多种作物资源的遗传多样性分析。
分子标记与数值分类相结合是研究植物遗传多样性的有效途径，已在许多作物中得到了应用。
在表型性状差异、染色体、蛋白质及DNA多态性等方面前人已对黄瓜种质资源遗传多样性做过一些研究。
李锡香等（1999，2004）通过对国家蔬菜种质资源库中的黄瓜资源表型性状分析发现，中国资源多样性丰富。
多样性鉴定与分类研究发现，长江以南黄瓜种质的遗传多样性高于长江以北，华南型种质的遗传多样性高于华北型种质。
中国栽培种质的遗传关系与形态特征和地域分布存在一定相关性。
司曼星等（2007）对黄瓜种质资源遗传多样性和亲缘关系进行分析，将177份不同生态类型的资源划分为5大类，大部分旱黄瓜被划分在第l类中，多数的华南类型和加工型黄瓜被划分在第2类中，大部分华北类型种质为第5类，欧洲温室型没有单独被划出来。
形态学聚类结果相似，但和分子标记分析存在一定差异。
王佳等（2007）用ISSR技术对46份黄瓜材料进行遗传多样性分析，以相似系数0.54为阈值可分为四大类，总体而言，来自同一生态型的多数资源可以聚在不同类或亚类中。
刘丽娟等（2009）用RAPD标记对黄瓜资源遗传相似性进行研究，发现22个品种间的平均遗传相似系数为0.8004，可分为4个群，说明黄瓜的遗传变异较低，遗传基础狭窄，品种的聚类结果与其生态型基本一致。
关于雌性系的选育和利用，亢秀萍等（2000）以欧洲温室黄瓜为原始材料，经3代选择得到雄花节位率为5％的雌性系。
以选育的雌性系为母本，自交系CH为父本配制的杂种一代“山农一号”具有强雌性、早熟性和高产性。
郭海等（2003）以黄瓜雌性系与雌雄同株系为亲本配制的杂交种“永昌9618”为试材，利用硝酸银溶液诱导雄花，通过连续3代株选，育成两个稳定遗传的密刺型黄瓜雌性系10-3和18-l。
通过备世代材料性型分化的调查，证明黄瓜的性型遗传为质量性状的简单遗传。
但进一步选育综合性状好，兼抗多种病害的优良雌性系，则要通过利用多个亲本回交转育基因重组而实现。
孙小镭等（2011）将从引种材料自交分离群体中筛选出的华南型黄瓜雌性系M16，经过多代回交、自交和母系选择构建了以新泰密刺自交纯合系X8为遗传背景的华北型黄瓜雌性系MC2065。
基因组重测序结果显示：
华北型雌性系MC2065与华北型雌雄同株系X8之间的同源性达到98％以上。
宋铁峰等（2012）利用白色果皮华南型黄瓜雌性系A31和绿色果皮雌雄同株系H5选育出绿色果皮华南型黄瓜雌性系Q6。
提出了由雌性系或雌型杂种选育出具有其他性状雌性系的选育方法。
尽管形态学性状鉴定周期长，可鉴别的位点有限，且易受环境等因素的影响，遗传表达不稳定。
但是，形态性状的鉴定和描述，更直接，简便，有利于在田间直接选择，仍然是种质资源研究的最基本方法和途径。
分子标记技术可从全基因组上揭示亲本的遗传变异，在亲本评价上有巨大的应用价值。
将几种检测方法综合应用，可取长补短，为资源的评价、核心种质的构建和特异资源的有效利用提供依据。
雌性系在作物育种中有着重要作用，但通过F1选育而来的雌性系，大多不能满足生产需求，不能直接利用，需进行回交转育，以改良亲本材料，再进行遗传配组，则可获得早熟、高产的一代杂交种。
三、研究开发内容和技术关键
1、研究开发内容
（1）在原有基础上，继续搜集华南型黄瓜种质资源，并对其主要农艺性状调查取值，进行聚类分析和遗传多样性研究，初步确立其与地理分布和生态型的关系。
（2）在依据形态表型聚类的基础上，初步借助RAPD、ISSR等分子标记技术对具代表性的黄瓜资源进一步进行遗传多样性研究。
（3）对现有黄瓜资源进行田间观察和性别鉴定，以期发现纯雌或强雌单株，并自交分离纯化，直到获得纯合稳定的雌性系材料。
（4）以综合性状优良的华南型黄瓜地方品种为轮回亲本，通过回交和自交进行雌性系转育，结合逐代人工选择，获得优良雌性系，并分析其基因同源性。
2、技术关键
（1）选择遗传力较高的容易被鉴别的质量性状和差异较大的数量性状为遗传标记。
按照李锡香和朱德蔚（2005）的方法进行性状调查，采用相关软件（SAS、SPSS、DPS、Excel）进行数据统计，应用最短距离法进行聚类分析。
（2）用NTSYS-pc（Version2.10）软件中的SIMQUAL程序计算相似系数，并获得相似系数矩阵，再用其中的SAHN程序和UPGMA方法进行聚类分析，最后通过Treeplot程序生成聚类图。
（3）通过苗期诱雄，对黄瓜资源中的雌性单株充分自交，直到获得纯合稳定的株系，再与优良的华南型黄瓜地方品种回交、自交，最终选育出优良雌性系。
四、预期目标（主要技术经济指标、知识产权申请情况、应用前景）
1、主要技术指标
（1）通过对华南型黄瓜种质资源主要农艺性状的调查，进行统计和聚类分析，揭示其遗传多样性表现，初步确立其与地理分布和生态型的关系。
（2）在依据形态表型聚类的基础上，初步借助RAPD、ISSR等分子标记技术对具代表性的黄瓜资源进一步聚类和遗传相似性研究，明确其多样性。
（3）对现有黄瓜资源进行田间观察和鉴定，以表现优良的华南型黄瓜地方品种为轮回亲本，结合自交、回交和逐代选择，获得优良雌性系1~2份。
（4）在省级以上刊物发表科研论文1~2篇。
2、应用前景
植物的遗传多样性可表现在形态、细胞、生理生化和分子等多个水平上，综合应用几种方法对栽培黄瓜种质资源进行遗传多样性研究，可充分了解黄瓜种质资源的多样性现状、分类地位和亲缘关系，为黄瓜育种实践中减少配制杂交组合的盲目性和数目，改良亲本和选配强优势杂交种，有效划分杂交优势群，提高品种质量及育种效率提供一定参考。
加快华南型黄瓜资源的引种、研究与利用，充分挖掘各种资源，尤其是优良地方品种资源的优势，选配优良组合，是丰富华南型黄瓜遗传基因库、开辟新的基因源，提高育种效率，改良品种，达到增产增效的有效途径。
黄瓜雌性系的育种优势表现在：
是异花授粉作物，一代杂种优势明显，增产效果显著。
利用雌性系配制一代杂种无需去雄，节约劳动力，降低制种成本，并且所制成的一代杂种的纯度很高，在生产上广泛使用。
性型表现与其成熟早晚、产量和品质等有密切关系。
黄瓜的雌性系往往表现出早熟、瓜密、采瓜期集中、丰产性强等优点。
可用单性结实雌性系和两性系杂交产生雌性单性结实杂种，其雌性率可达100％，增产效益十分显著。
但雌性系自身繁殖较为困难，国外通常是以配套的全同株系给其授粉以获得种子，或利用化学药剂处理幼苗。
国内主要用赤霉素、硝酸银和硫代硫酸银作诱雄剂。
另外，纯雌株类型往往化瓜率较高，因此，选育单性结实能力强的黄瓜雌性系将是今后育种的重点。
五、研究方案、技术路线、组织方式与课题分解
1、研究方案
（1）通过种质交流、购买等多种途径继续搜集引进华南型黄瓜种质资源，选择大小和分布合适的黄瓜群体进行种植和管理。
（2）选择和确立黄瓜主要性状描述规范和数据标准，对其形态、品质、产量、抗耐性等相关农艺性状调查取值和数据处理。
（3）在相关工作基础上，借助RAPD、ISSR等分子标记技术在选定的黄瓜群体中进行PCR扩增和成像，获得其带型数据。
（4）采用相关软件（SAS、SPSS等）进行数据统计，应用NTSYS-pc（Version2.10）软件和UPGMA方法进行聚类和多样性分析。
（5）结合课题前期工作，继续对纯雌或强雌黄瓜单株进行鉴定，运用测交和自交分离纯化，以获得遗传稳定的雌性系材料。
（6）通过回交、自交和逐代选择，转育雌性基因到表现优良的华南型黄瓜地方品种中，以获得适合区域生产的雌性系材料。
2、技术路线
（1）遗传多样性分析
（2）黄瓜雌性系转育
3、组织方式与课题分解
项目由申请单位负责课题的组织、实施、协调和运行，采取主持人负责制，全面负责实验内容的制定、实验方案的设计及具体实施、人员和经费的使用等。
同时，将课题分解为种质资源田间鉴定、分子标记技术应用、雌性系选育、集中示范等主要内容，采用专人负责、分工又协作的方式。
项目执行年度计划及总结制度，实行课题组成员定期例会制，着力解决在种质资源使用、技术方法应用、实验方案实施、目标结果实现、物质投入、交流合作等研究实施过程中遇到的关键性难题，根据实验研究进展，合理修正方法路线和技术指标，加强交流协作和资源共享，确保项目的按期顺利完成。
六、计划进度安排
1、2013.01-2014.01：
（1）华南型黄瓜种质资源的继续引种搜集，主要农艺性状田间调查，初步完成数据的统计和处理。
（2）在原有工作基础上，对纯雌或强雌黄瓜单株进行田间鉴定，用强雌性植株的雄花和纯雌性植株的雌花测交，继续对相关雌性中间材料分离纯化，初步获得纯合稳定的雌性系。
2、2014.01-2015.01
（1）补充完善黄瓜种资主要农艺性状表型数据的调查和处理，并借助相关软件进行基本统计、聚类和主成分分析，完成其遗传多样性的计算和分析。
（2）继续分离纯化雌性材料，以优良的华南型黄瓜地方品种为轮回亲本，进行回交和自交，并对后代群体进行人工选择和淘汰，加快雌性系的转育。
3、2015.01-2016.01
（1）在基于形态性状聚类和遗传多样性分析的基础上，辅之分子标记技术，进一步研究具代表性黄瓜资源的遗传多样性。
（2）继续对获得的雌性系中间材料进行回交、自交和逐代选择，最终得到整体表现优良符合区域生产需要的雌性系材料。
4、2016.01-2016.12
（1）完成对所获优良雌性系及其轮回双亲三者遗传物质的提取、扩增、克隆和测序，分析其相互之间基因的同源性。
（2）试验的整体补充与完善，材料总结，准备结题。
七、现有工作基础和条件
1、工作基础
申请人所在课题组成员拥有高级职称1人，中级职称5人，具有较强的科研创新能力。
课题组自上世纪90年代开始黄瓜种质资源的引进、鉴定、筛选和应用推广工作，目前已收集整理温州地方和国内外黄瓜品种资源近百份，同时进行地方品种的提纯复壮、F1杂交种的分离纯化，初步筛选出各种类型的优良种质资源，如雌性系材料、单性结实材料、耐低温弱光材料、早熟材料、抗病抗逆材料等，为进一步资源分类和雌性系选育打下了坚实基础。
2、工作条件
申请单位是一所综合性的农业科研与教学单位，拥有良好的科研传统和科研基础，具有一支较强的科研队伍，近年来，不断拓宽和加深与省农科院、浙江大学、南京农业大学等知名科研院所和高校的交流与合作，注重人员互访和资源共享。
本项目依托申请单位的重点实验室、开放实验平台，仪器设备齐全、分子生物学实验条件完备，拥有项目实施所需的PCR扩增仪、紫外分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统、冷冻离心机、超低温冰箱等主要仪器设备，建有温室、连栋大棚等配套基地设施，为本研究的顺利开展提供了必要的物质保障和技术支持。
八、经费预算
总经费：
15万元（申请拨款15万元），具体预算如下：
序号
科目
预算金额（万元）
计算依据及用途
1
能源材料费
1.5
引种、制种及农用物质投入等
2
设计实验费
8.0
药剂、仪器使用和委托服务等
3
信息费
0.5
文献检索、材料总结、论文发表等
4
会议调研费
1.5
参加学术会议及交流合作等
5
验收费
0.5
项目会议评审、结题验收等
6
人员费
3.0
科辅、临时工劳务酬金等
升级会员 