敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制完整版.docx

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敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制完整版

2020-2021敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制（完整版）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是指除外酒精性和其他明确肝损伤因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的代谢综合征，包括非酒精性脂肪肝（non-alcoholicfattyliver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis，NASH）和NASH相关性肝纤维化，可进展为肝硬化、肝癌。

氧化应激在NAFLD的发生、发展中发挥重要作用。

氧化应激产物如活性氧会损伤核酸、蛋白质和脂类，进而对细胞产生更大损伤。

氧化应激也可诱导炎症因子的产生，从而加重肝脏炎症，进一步促进肝纤维化的发生[]。

因此，氧化应激是NAFLD进展的中心环节。

改善氧化应激是控制NAFLD进展的重要转折点。

近来研究提示自噬可减轻氧化应激并延缓NAFLD的进展[。

据报道，NAFLD与肝脏自噬功能下调有关，而恢复自噬可逆转肝脂肪酸积累诱导的胰岛素抵抗]。

心磷脂是定位于线粒体的磷脂，在维持线粒体结构和功能方面起重要作用，对线粒体嵴的发生，线粒体的融合、分裂，以及线粒体呼吸链复合物的形成至关重要[。

心磷脂还参与自噬的整个过程，诱导功能失调的线粒体发生线粒体自噬[。

研究表明，心磷脂酰基转移酶1（Acyl-CoA：

lysocardiolipinacyltransferase1，ALCAT1）可通过心磷脂的病理性重塑来调控线粒体功能障碍和氧化应激。

ALCAT1表达上调在衰老相关疾病（如肥胖、2型糖尿病和心脑血管疾病等）的线粒体功能障碍中起关键作用，靶向失活ALCAT1则可防止各种衰老相关疾病的发生[]。

ALCAT1可通过加剧氧化应激反应并减弱丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threoninekinase，AKT）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）信号转导加剧肥厚性心肌病的病理进程[]。

然而，关于ALCAT1在NAFLD中作用的研究较少。

因此，本研究旨在通过构建脂肪肝细胞模型，探讨ALCAT1对NAFLD发生、发展的影响及其可能作用机制。

材料与方法

一、研究材料

人正常肝细胞（L-02细胞；中国科学院），RPMI（RoswellParkMemorialInstitute）-1640培养基（美国Gibco公司），荧光显微镜[奥林巴斯（中国）有限公司]，细胞计数试剂盒8（cellcountingkit-8，CCK-8；日本同仁化学研究所），SMART®MMLV反转录试剂盒（日本TaKaRa公司），SYBR绿色实时荧光定量PCRSuperMix试剂盒（美国ABI公司），IL-6ELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒（美国Prointech公司），活性氧ELISA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、丙二醛ELISA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）ELISA试剂盒（上海邦景实业有限公司），ALCAT1抗体（美国奥维亚系统生物公司），β-肌动蛋白（β-actin）抗体、AKT抗体、磷酸化AKT抗体、mTOR抗体和酵母ATG6同源物（Beclin1）抗体（美国CellSignalingTechnology公司），微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3）-Ⅰ、LC3-Ⅱ（美国Novus公司），羊抗兔二抗（美国Jackson公司）。

二、脂肪肝细胞模型的建立和ALCAT1的表达鉴定

将L-02细胞在添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37℃，体积分数为0.05的CO2恒温、恒湿培养箱[]。

铺96孔板，每孔1.0×104个细胞，以游离脂肪酸（freefattyacids，FFA；即亚油酸和棕榈酸混合浓度为0.5mmol/L、混合比例为2∶1的混合物）处理细胞24h，建立脂肪肝细胞模型。

以1%牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）处理的L-02的细胞作为对照[]。

然后用浓度为1mg/L的尼罗红孵育10min。

在543nm激发波长和598nm发射波长下记录图像。

在荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型L-02细胞脂质沉积情况。

采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况。

三、ALCAT1siRNA转染

使用Lipofectamine®2000将荧光素酰胺标记的ALCAT1小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）瞬时转染L-02细胞，选择3种序列的ALCAT1siRNA片段，其中ALCAT1siRNA1序列为5′-GCCUCAAAGCGAGUCUCAATT-3′（正向）和5′-UUGAGACUCGCUUUGAGGCTT-3′（反向），ALCAT1siRNA2序列为5′-CCACUUCAACUCCUCAUAUTT-3′（正向）和5′-AUAUGAGGAGUUGAAGUGGTT-3′（反向），ALCAT1siRNA3序列为5′-GCUGCAAGAGA-GAAUAUUUTT-3′（正向）和5′-AAAUAUUCUCU-CUUGCAGCTT-3′（反向）。

以空白对照（无siRNA转染的L-02细胞）和空载siRNA（以空载siRNA转染L-02细胞）作为阴性对照。

空载siRNA序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′（正向）和5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′（反向）。

将1μg空载质粒和ALCAT1siRNA质粒悬浮于200μL无血清OptiMEM培养基中，分别形成siRNA/脂质体混合物。

然后将混合物加入6孔板中，每孔1.0×104个细胞，转染6～48h，用荧光显微镜观察转染效率。

采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法测定3种ALCAT1siRNA片段干预后ALCAT1基因和蛋白质的相对表达水平，选择干预效果最佳的ALCAT1siRNA用于后续实验。

四、实时荧光定量PCR检测

去除细胞培养液后，PBS冲洗细胞3次，用TRIzol试剂从实验细胞中提取总RNA，用SMART®MMLV反转录试剂盒反转录合成cDNA。

根据说明书，用SYBR绿色实时荧光定量PCRSuperMix试剂盒检测目的基因的表达。

以β-actin基因作为管家基因[]。

ALCAT1引物序列为5′-CACCCTACCTGT-GGCATTATTG-3′（正向）和5′-CCATTCTTGTCCG-ATGGTTCAT-3′（反向）；β-actin引物序列为5′-CATGTACGTTGCTATCC-AGGC-3′（正向）和5′-CTCCTTAATGTCACGCA-CGAT-3′（反向）。

五、透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构

胰酶消化细胞，PBS洗涤，1500r/min（离心半径为14cm）离心5min，弃上清液，加入1mL2.5%戊二醛溶液固定过夜，PBS清洗。

1%锇酸溶液4℃固定2h，PBS清洗，分别用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min，置于70%乙醇中过夜，用无水乙醇脱水，丙酮置换，包埋、切片。

采用醋酸双氧铀和醋酸铅染色，置于透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构。

六、CCK-8检测细胞活力

L-02细胞铺96孔板，每孔1.0×104个细胞，置于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜。

设立空白对照组、脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组。

空白对照组以常规RPMI-1640培养基培养L-02细胞48h；脂肪肝细胞模型组以空载siRNA质粒转染L-02细胞24h，然后用含FFA培养基处理细胞24h；ALCAT1干预组先用ALCAT1siRNA转染细胞24h，然后以含FFA的培养基继续处理24h。

每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃继续培养1h。

在酶联免疫检测仪450nm波长处测量各孔的吸光度值。

计算空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞活力。

七、蛋白质印迹法

采用蛋白质印迹法测定各组自噬体标志物LC3-Ⅱ和Beclin1，以及mTOR信号通路关键蛋白mTOR和磷酸化AKT的表达水平，具体方法如下。

用含1mmol/L苯甲基磺酰氟的冷冻裂解缓冲液提取L-02细胞样品中的蛋白质。

然后用二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）法检测试剂盒测定蛋白质浓度。

将每个样品中的等量蛋白质运用12%SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移至PVDF膜上。

用5%牛奶在室温下封闭膜2h，加入第一抗体在4℃孵育过夜，再加入HRP结合的山羊抗鼠第二抗体在室温下孵育1h，然后用电化学发光系统检测印迹。

第一抗体为β-actin、ALCAT1、AKT、磷酸化AKT、mTOR、Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ（稀释比例均为1∶1000）。

第二抗体为HRP结合的羊抗鼠血清（稀释比例为1∶10000）。

八、ELISA检测氧化应激产物和炎症因子的表达

收集空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞培养上清液，使用丙二醛、4-HNE和活性氧ELISA试剂盒检测氧化应激产物丙二醛、4-HNE和活性氧的表达，用IL-6和TNF-αELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达。

九、统计学方法

应用SPSS22.0和GraphPadPrism5.0软件进行统计学分析。

呈正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。

P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况

尼罗红染色结果显示，FFA诱导建立的脂肪肝细胞模型组中L-02细胞呈现明显的脂滴沉积（图1）。

实时荧光定量PCR检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的mRNA表达水平高于阴性对照组（9.26±0.83比1.02±0.12），差异有统计学意义（t＝9.82，P<0.05）。

见图2，蛋白质印迹法检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的蛋白质表达水平高于阴性对照组（0.35±0.02比0.17±0.01），差异有统计学意义（t＝6.83，P<0.05）。

图1免疫荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型细胞中脂滴沉积情况　低倍放大　A　阴性对照细胞核　DAPI染色　B　阴性对照　尼罗红染色　C　阴性对照　合成图片　D　脂肪肝细胞模型细胞核　DAPI染色　E　脂肪肝细胞模型　尼罗红染色　F　脂肪肝细胞模型　合成图片

二、ALCAT1siRNA转染效果验证

见表1和图3，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，ALCAT1siRNA1、ALCAT1siRNA2和ALCAT1siRNA3可不同程度地降低L-02细胞中ALCAT1在蛋白质和mRNA水平的表达，以ALCAT1siRNA3的干预效果最佳。

因此，选择ALCAT1siRNA3用于后续实验。

三、敲减ALCAT1对脂滴沉积、线粒体自噬和细胞活力的影响

透射电子显微镜结果显示，脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的脂滴沉积量均高于空白对照组（17.67±3.52和7.67±0.33比4.33±0.33），差异均有统计学意义（t＝3.76、7.07，P均<0.05）；ALCAT1干预组的脂滴沉积量低于脂肪肝细胞模型组（7.67±0.33比17.67±3.52），差异有统计学意义（t＝2.82，P<0.05）。

透射电子显微镜下（图4）观察细胞的超微结构，结果表明