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1、敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制完整版2020-2021敲减心磷脂酰基转移酶1对肝细胞脂肪变和氧化应激的影响及其机制（完整版）非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精性和其他明确肝损伤因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的代谢综合征，包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)和NASH相关性肝纤维化，可进展为肝硬化、肝癌。氧化应激在NAFLD的发生、发展中发

2、挥重要作用。氧化应激产物如活性氧会损伤核酸、蛋白质和脂类，进而对细胞产生更大损伤。氧化应激也可诱导炎症因子的产生，从而加重肝脏炎症，进一步促进肝纤维化的发生。因此，氧化应激是NAFLD进展的中心环节。改善氧化应激是控制NAFLD进展的重要转折点。近来研究提示自噬可减轻氧化应激并延缓NAFLD的进展。据报道，NAFLD与肝脏自噬功能下调有关，而恢复自噬可逆转肝脂肪酸积累诱导的胰岛素抵抗。心磷脂是定位于线粒体的磷脂，在维持线粒体结构和功能方面起重要作用，对线粒体嵴的发生，线粒体的融合、分裂，以及线粒体呼吸链复合物的形成至关重要。心磷脂还参与自噬的整个过程，诱导功能失调的线粒体发生线粒体自噬。研究表

3、明，心磷脂酰基转移酶1(Acyl-CoA：lysocardiolipin acyltransferase 1，ALCAT1)可通过心磷脂的病理性重塑来调控线粒体功能障碍和氧化应激。ALCAT1表达上调在衰老相关疾病(如肥胖、2型糖尿病和心脑血管疾病等)的线粒体功能障碍中起关键作用，靶向失活ALCAT1则可防止各种衰老相关疾病的发生。ALCAT1可通过加剧氧化应激反应并减弱丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号转导加剧肥厚性心肌病的病理进程。然而，关于ALCA

4、T1在NAFLD中作用的研究较少。因此，本研究旨在通过构建脂肪肝细胞模型，探讨ALCAT1对NAFLD发生、发展的影响及其可能作用机制。材料与方法一、研究材料人正常肝细胞(L-02细胞；中国科学院)，RPMI(Roswell Park Memorial Institute)-1640培养基(美国Gibco公司)，荧光显微镜奥林巴斯(中国)有限公司，细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8；日本同仁化学研究所)，SMARTMMLV反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，SYBR绿色实时荧光定量PCR SuperMix试剂盒(美国ABI公司)，IL-6 ELISA试剂盒、

5、TNF- ELISA试剂盒(美国Prointech公司)，活性氧ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、丙二醛ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)ELISA试剂盒(上海邦景实业有限公司)，ALCAT1抗体(美国奥维亚系统生物公司)，-肌动蛋白(-actin)抗体、AKT抗体、磷酸化AKT抗体、mTOR抗体和酵母ATG6同源物(Beclin1)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light cha

6、in 3，LC3)-、LC3-(美国Novus公司)，羊抗兔二抗(美国Jackson公司)。二、脂肪肝细胞模型的建立和ALCAT1的表达鉴定将L-02细胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37 ，体积分数为0.05的CO2恒温、恒湿培养箱。铺96孔板，每孔1.0104个细胞，以游离脂肪酸(free fatty acids，FFA；即亚油酸和棕榈酸混合浓度为0.5 mmol/L、混合比例为21的混合物)处理细胞24 h，建立脂肪肝细胞模型。以1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)处理的L-

7、02的细胞作为对照。然后用浓度为1 mg/L的尼罗红孵育10 min。在543 nm激发波长和598 nm发射波长下记录图像。在荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型L-02细胞脂质沉积情况。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况。三、ALCAT1 siRNA转染使用Lipofectamine2000将荧光素酰胺标记的ALCAT1小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)瞬时转染L-02细胞，选择3种序列的ALCAT1 siRNA片段，其中ALCAT1 siRNA1序列为5-GCCUCAAAGCGAGUCUCAATT-3(正向)和

8、5-UUGAGACUCGCUUUGAGGCTT-3(反向)，ALCAT1 siRNA2序列为5-CCACUUCAACUCCUCAUAUTT-3(正向)和5-AUAUGAGGAGUUGAAGUGGTT-3(反向)，ALCAT1 siRNA3序列为5-GCUGCAAGAGA-GAAUAUUUTT-3(正向)和5-AAAUAUUCUCU-CUUGCAGCTT-3(反向)。以空白对照(无siRNA转染的L-02细胞)和空载siRNA(以空载siRNA转染L-02细胞)作为阴性对照。空载siRNA序列为5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3(正向)和5-ACGUGACACGUUCGGAGAA

9、TT-3(反向)。将1 g空载质粒和ALCAT1 siRNA质粒悬浮于200 L无血清Opti MEM培养基中，分别形成siRNA/脂质体混合物。然后将混合物加入6孔板中，每孔1.0104个细胞，转染648 h，用荧光显微镜观察转染效率。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法测定3种ALCAT1 siRNA片段干预后ALCAT1基因和蛋白质的相对表达水平，选择干预效果最佳的ALCAT1 siRNA用于后续实验。四、实时荧光定量PCR检测去除细胞培养液后，PBS冲洗细胞3次，用TRIzol试剂从实验细胞中提取总RNA，用SMARTMMLV反转录试剂盒反转录合成cDNA。根据说明书，用SYBR绿色实

10、时荧光定量PCR SuperMix试剂盒检测目的基因的表达。以-actin基因作为管家基因。ALCAT1引物序列为5-CACCCTACCTGT-GGCATTATTG-3(正向)和5-CCATTCTTGTCCG-ATGGTTCAT-3(反向)；-actin引物序列为5-CATGTACGTTGCTATCC-AGGC-3(正向)和5-CTCCTTAATGTCACGCA-CGAT-3(反向)。五、透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构胰酶消化细胞，PBS洗涤，1 500 r/min(离心半径为14 cm)离心5 min，弃上清液，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定过夜，PBS清洗。1%

11、锇酸溶液4 固定2 h，PBS清洗，分别用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15 min，置于70%乙醇中过夜，用无水乙醇脱水，丙酮置换，包埋、切片。采用醋酸双氧铀和醋酸铅染色，置于透射电子显微镜下观察脂滴沉积、线粒体形态、自噬体结构。六、CCK-8检测细胞活力L-02细胞铺96孔板，每孔1.0104个细胞，置于37 、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜。设立空白对照组、脂肪肝细胞模型组、ALCAT1干预组。空白对照组以常规RPMI-1640培养基培养L-02细胞48 h；脂肪肝细胞模型组以空载siRNA质粒转染L-02细胞24 h，然后用含FFA培养基处理细胞24 h；

12、ALCAT1干预组先用ALCAT1 siRNA转染细胞24 h，然后以含FFA的培养基继续处理24 h。每孔加入10 L CCK-8溶液，37 继续培养1 h。在酶联免疫检测仪450 nm波长处测量各孔的吸光度值。计算空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞活力。七、蛋白质印迹法采用蛋白质印迹法测定各组自噬体标志物LC3-和Beclin1，以及mTOR信号通路关键蛋白mTOR和磷酸化AKT的表达水平，具体方法如下。用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的冷冻裂解缓冲液提取L-02细胞样品中的蛋白质。然后用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测试剂盒测定蛋白质浓

13、度。将每个样品中的等量蛋白质运用12% SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移至PVDF膜上。用5%牛奶在室温下封闭膜2 h，加入第一抗体在4 孵育过夜，再加入HRP结合的山羊抗鼠第二抗体在室温下孵育1 h，然后用电化学发光系统检测印迹。第一抗体为-actin、ALCAT1、AKT、磷酸化AKT、mTOR、Beclin1、LC3-和LC3-(稀释比例均为11 000)。第二抗体为HRP结合的羊抗鼠血清(稀释比例为110 000)。八、ELISA检测氧化应激产物和炎症因子的表达收集空白对照组、脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的细胞培养上清液，使用丙二醛、4-HNE和活性氧ELISA试剂盒检测氧

14、化应激产物丙二醛、4-HNE和活性氧的表达，用IL-6和TNF- ELISA试剂盒检测炎症因子IL-6和TNF-的表达。九、统计学方法应用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以 s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。结果一、ALCAT1在脂肪肝细胞模型中的表达情况尼罗红染色结果显示，FFA诱导建立的脂肪肝细胞模型组中L-02细胞呈现明显的脂滴沉积(图1)。实时荧光定量PCR检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的mRNA表达水平高于阴性对照组(9.260.83比1.0

15、20.12)，差异有统计学意义(t9.82，P0.05)。见图2，蛋白质印迹法检测结果显示，脂肪肝细胞模型组中ALCAT1的蛋白质表达水平高于阴性对照组(0.350.02比0.170.01)，差异有统计学意义(t6.83，P0.05)。图1免疫荧光显微镜下观察脂肪肝细胞模型细胞中脂滴沉积情况低倍放大A阴性对照细胞核DAPI染色B阴性对照尼罗红染色C阴性对照合成图片D脂肪肝细胞模型细胞核DAPI染色E脂肪肝细胞模型尼罗红染色F脂肪肝细胞模型合成图片二、ALCAT1 siRNA转染效果验证见表1和图3，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示，ALCAT1 siRNA1、ALCAT1 siRN

16、A2和ALCAT1 siRNA3可不同程度地降低L-02细胞中ALCAT1在蛋白质和mRNA水平的表达，以ALCAT1 siRNA3的干预效果最佳。因此，选择ALCAT1 siRNA3用于后续实验。三、敲减ALCAT1对脂滴沉积、线粒体自噬和细胞活力的影响透射电子显微镜结果显示，脂肪肝细胞模型组和ALCAT1干预组的脂滴沉积量均高于空白对照组(17.673.52和7.670.33比4.330.33)，差异均有统计学意义(t3.76、7.07，P均0.05)；ALCAT1干预组的脂滴沉积量低于脂肪肝细胞模型组(7.670.33比17.673.52)，差异有统计学意义(t2.82，P0.05)。透射电子显微镜下(图4)观察细胞的超微结构，结果表明