酸溶蛋白和粗蛋白测定.docx

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酸溶蛋白和粗蛋白测定

油脂的检验与分析

粗蛋白质的测定（凯氏半微量定氮法）

测定原理凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解，其中氮元素变成铵盐。

再经浓碱液作用，放出的氨气经硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收的氨。

计算出试样含氮量，乘以相关的蛋白质换算系数，即得打蛋白质的含量。

消化：

蛋白质与浓硫酸混合加热，蛋白质被炭化分解，其中碳被氧化成二氧化碳，所含的氮则转变成硫酸铵残留于消化液中。

有机物（含N、C、H、O、P、S等元素）+H2SO4CO2↑＋（NH4）2SO4＋H3PO4＋SO2↑＋SO3↑

由于上述反应进行的很慢，消化需要很长时间，加入催化剂可加速反应。

硫酸铜是备用的催化剂，硫酸钾能提高硫酸的沸点，常将它们混合使用，起加速氧化、促进有机物分解的作用。

蒸馏：

消化所得的硫酸铵加碱蒸馏，氨就被释放出来。

（NH4）2SO4＋2NaOH＝2NH3·H2O＋Na2SO4

NH3·H2O＝NH3↑＋H2O

生成的氨用硼酸溶液吸收。

硼酸吸收氨后，指示剂颜色变化，再用盐酸滴定，直至恢复到原来的氢离子浓度为止，盐酸与样品中氨是等摩尔反应。

2NH3＋4H3BO3＝（NH4）2B4O7＋5H2O

（NH4）2B4O7＋2HCl＋5H2O＝2NH4Cl＋4H3BO3

由于各种蛋白质的含氮量通常为16％左右，将含氮量乘以蛋白质系数，即为粗蛋白质含量。

试剂

浓硫酸—过氧化氢—水混合液（2＋3＋1）。

在100mL水中缓慢加入浓硫酸200mL，冷却后加入30％过氧化氢300mL，混匀备用，此液存放阴凉处可保存一个月。

混合催化剂。

10g硫酸铜（CuSO4·5H2O）、100g硫酸钾、0.2g硒粉，在研钵中研细，通过孔径0.45mm筛，混匀后备用。

40g/100mL氢氧化钠溶液、2％硼酸溶液、0.01mol/L盐酸溶液。

甲基红乙醇溶液：

称取0.1g甲基红置于研钵中，加入少许95％乙醇，研磨溶解后加入75mL95％乙醇。

次甲基蓝乙醇溶液：

0.1g次甲基蓝溶于80mL95％乙醇中，临用时将以上两液按2：

1比例混合即成。

在酸域呈紫红色，PH＝5.5时无色，在碱域呈绿色。

仪器50mL凯氏烧瓶、1000mL圆底烧瓶、100mL锥形瓶、5mL（刻度0.01mL）微量滴定管、50mL容量瓶、5mL移液管、凯氏蒸馏装置。

操作方法

消化。

用长条光滑纸称取试样0.2～0.3g，精确到0.0001g（约含粗蛋白质10～30mg）直接送入凯氏烧瓶底部，加混合催化剂1g，同时加入硫酸＋过氧化值＋水混合液3～5mL，稍加振摇，斜置于电炉上。

在通风橱内加热进行消化。

开始时用低温加热，切勿使瓶中泡沫超过瓶肚的2/3，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。

直至消化液呈浅蓝绿色的透明状时再继续加热沸腾10min，取出，待消化液冷却至室温后，加水至10～20mL。

溶液温度降到室温后，将消化液移入50mL容量瓶中，并用少量水将凯氏烧瓶冲洗3～4次，洗涤液一并移入容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀备用。

蒸馏。

凯氏微量蒸馏装置它是由蒸汽发生器、反应瓶、及冷凝管等组成，在大烧瓶8（容量1000mL）中加入蒸馏水400mL和少量碎玻璃片，加5滴混合指示剂，加几滴酸液，使水呈紫红色，盖紧瓶塞，连接4、1、2并检查有无漏气。

量取30mL2％硼酸溶液，注入（100mL）三角瓶3内，作为承接器，加混合指示剂1～2滴（溶液呈紫红色），置于冷凝管2下面，使管尖端插入硼酸溶液1cm深处。

用5mL移液管吸取5mL（V）试样稀释液，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再倒入蒸馏水10mL冲洗漏斗5。

接着量取40g/100mL氢氧化钠溶液10mL，由漏斗5注入蒸馏瓶1内，再用2～5mL水冲洗漏斗5，旋紧活塞，此时蒸馏瓶1内溶液总体积应不超过容积的一半。

打开电炉加热烧瓶8，打开簧夹7，关闭活塞6，使蒸汽通过回流管4进入蒸馏瓶1再由蒸馏瓶1经冷凝管2而流入三角瓶3，待三角瓶3内的溶液呈绿色时，开始记录时间，经2～3min后,将三角瓶3放低，使冷凝管2下端离开液面，继续蒸馏1min，然后用少量无CO2蒸馏水冲洗冷凝管2下端，蒸馏即告结束。

蒸馏结束后，旋紧簧夹7断绝蒸汽。

这时由于回流管4内蒸汽压立即降低，所以蒸馏瓶1内的液体则全部吸入回流管4内。

然后打开漏斗5下的簧夹，注入蒸馏水40～50mL于蒸馏瓶1内，关闭漏斗5下的簧夹，打开簧夹7，通入蒸汽加热洗涤蒸馏瓶1，再断绝蒸汽，使洗涤回流至回流管4中，打开活塞6，将回流管4中废液弃去，关闭活塞6，为下次蒸汽做好准备。

滴定。

用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定三角瓶3中的吸收液至出现淡紫色为止。

记录所消耗盐酸标准溶液的体积（V1）。

空白试验除不加试样外，消化、蒸馏、滴定操作与样品相同。

结果计算粗蛋白质的干基含量按下式计算：

（V2－V1）·c×0.0140×6.25

W（％）＝×100

V′

m×

V

式中V2----滴定试样时所需标准盐酸溶液的体积，mL；

V1----滴定空白时所需标准盐酸溶液的体积，mL；

c-----盐酸标准溶液浓度，mol/L；

m------试样的质量，g；

V------试样分解液总体积，mL；

V′---试样分解液蒸馏用体积，mL；

0.0140-----与1.00mL盐酸标准溶液「c（HCl）＝1.000mol/L」相当的以克表示的氮的质量。

6.25-----氮换算成蛋白质的平均系数。

双实验结果允许差：

粗蛋白质含量在15％以下时，不超过0.2％；粗蛋白质含量在15％以上时，不超过0.4％。

求其平均数，即为测定结果，测定结果取小数点后一位

粗蛋白质（％）＝

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