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葡萄糖苷酶酶活测定优化
本科毕业论文
题目红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶酶活测
定条件优化
学院食品科学与工程学院
专业生物工程
毕业届别2014届
姓名贾滔
指导教师王婧
职称副教授
甘肃农业大学教务处制二〇一四年六月
红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的酶活测定条件优化
贾滔
（甘肃农业大学食品科学与工程学院生物工程班2010级）
摘要：
以红佳酿酵母菌株为出发菌株，对其β-葡萄糖苷酶的酶活性测定条件进行研究。
通过单因素试验研究了缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物浓度对β-葡萄糖苷酶活力的影响，并采用正交试验确定了最佳酶活测定条件。
结果表明：
缓冲液pH值5.0；反应时间为10min;反应温度为50℃；底物浓度为40mmol/L，在此条件下红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力最高，达到47.58±0.58U/mL。
关键词：
红佳酿；β-葡萄糖苷酶；酶活;测定方法；优化
Tooptimizethemeasurementconditionsaboutenzymeactivityofvintageredβ-glycosidase
JiaTao
（GansuAgriculturalUniversityFoodscienceandengineeringcollegeBiologicalengineeringclassTheclassof2010）
Abstract:
Inordertoresearchthemeasurementconditionsaboutenzymeactivityofβ-glycosidase，usevintageredstrainsforteststrains．TheeffectofbufferpHvalue，reactiontime，temperatureandsubstrateconcentrationonenzymeactivityofβ-glycosidasewasstudiedbythemethodofsinglefactorexperiment，andwedeterminesthebestconditionsfortheenzymeactivitybyapplyingtheorthogonaltest．TheresultsshowedthatenzymeactivityofRedwineyeastβ-glycosidaseisthehighestundertheconditionofbuffersolutionpHvaluewas5.0，reactiontimewas10min，temperaturewas50℃andsubstrateconcentrationwas40mmol/L．Reached47.58±0.58U/mL。
Keywords:
Vintagered;β-glucosidase;Activity;Determination;Optimization
前言
β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），全称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobias，CB或β-G）和苦杏仁苷酶。
它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。
1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶[1]，因此苦杏仁成为了β-葡萄糖的经典来源。
随着现代科学的不断进步，在很多地方都发现β-葡萄糖苷酶较普遍的来源是植物的种子和微生物。
β-葡萄糖苷酶主要用于纤维素的降解[2]、葡萄酒的增香[3]等。
β-葡萄糖苷酶可水解糖苷键合态风味前体物，是葡萄酒风味修饰的关键酶[4]。
葡萄酒中的β-葡萄糖苷酶来源于葡萄果实、商品酶制剂（多源于丝状真菌）、酵母（酿酒酵母和非酿酒酵母）和乳酸菌[5]，其中酵母来源β-葡萄糖苷酶在酿造过程中起着重要作用[6]。
因此建立葡萄浆果和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶活性的快速准确的分析方法，对于增强葡萄酒中的香气和提高葡萄酒的质量意义重大。
β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷（pNPG）、纤维二糖、水杨苷等。
由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性[7]。
但据文献中p-NPG法测酶活力时所用的反应时间、反应温度、反应pH和底物浓度等条件各不相同，因此不同来源β-葡萄糖苷酶酶学性质有较大差异，导致酶活力定义有所不同，使得各文献中菌株酶活力的大小难以比较[7]。
本试验采用国内目前葡萄酒产业普遍应用的商业酿酒酵母中胞外酶活较高的菌种之一红佳酿酵母菌（VR），对其所产的β-葡萄糖苷酶的测活条件进行优化。
通过单因素及正交试验优化酶活力测定条件，旨在为统一酵母来源β-葡萄糖苷酶活力测定方法，促进高产菌株筛选及其产酶条件的研究提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌株
商品酵母：
VintageRed（VR），意大利Enartis公司。
1.1.2主要药品
p-NPG（4-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside，纯度＞98%），美国Sigma公司；
蛋白胨，酵母浸粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；
对硝基苯酚（p-NP）购自天津市凯信化学工业有限公司；
葡萄糖，无水磷酸氢二钠，柠檬酸，无水碳酸钠等均为国产分析纯。
1.1.3供试培养基
YPD液体培养基：
葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，超纯水，pH5.0；121℃灭菌20min。
产酶（发酵）培养基：
酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，NH4NO30.3%,KH2PO40.4%,121℃，灭菌20min,在温度降为70℃左右加入0.1%对硝基苯酚β-D葡萄糖苷（p-NPG）。
1.1.4主要仪器与设备
CP214电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；
HH-S型恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器制造有限公司）；
Genesis10s紫外可见分光光度计（美国ThermoScientific公司）；
GZX-GF101-
电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；
18100摩尔超纯水机（重庆摩尔水处理设备有限公司）；
H2050R台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；
NRY-200空气恒温摇床（上海南荣实验室设备有限公司）；
SW-CJ-2FD洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；
SPX-150-
生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；
1.2试验方法
1.2.1菌株活化
按推荐用量（0.2g/L）称取5℃保存的供试商品活性干酵母（红佳酿），接种至50倍体积的YPD液体培养基中，37℃活化20min。
1.2.2粗酶液的制备
活化后的菌株按10%接种量接种至装有50mL（250mL三角瓶）的发酵培养基中，28℃，180r/min，摇床培养48h，将发酵液8000r/min离心10min，去除沉淀，收集上清液即为粗酶液。
试验重复3次。
1.2.3β-葡萄糖苷酶活力的测定
1.2.3.1标准曲线绘制
称取对硝基苯酚139.0mg，用蒸馏水定容至1000mL，分别吸取该溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于100mL容量瓶中，用1mol/LNa2CO3溶液定容后混匀。
以蒸馏水作为空白，于400nm处测其吸光值。
以p-NP溶液浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线方程，得线性回归方程、相关系数分别为：
y=19.882x+0.0017，R2=0.9991，n=5。
1.2.3.2β-葡萄糖苷酶活力性测定
胞外酶：
取100μL上清液，加入200μLp-NPG（5mmol/L溶于pH值5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，P-C缓冲液）混匀，50℃反应30min，立即加入2mL1mol/LNa2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值[8]。
摩尔消光系数为：
ε=18300M-1·cm-1[9]
β-葡萄糖苷酶酶活力单位（U）定义为：
在pH5.0，50℃反应条件下，1毫升酶液1分钟水解p-NPG产生p-NP的量（nmol）为一个酶活单位（U）
1.2.3.3酶活力计算
式中：
U为酶活力单位（U/mL），c为对硝基苯酚的浓度，V为反应体系的体积，N为原酶液稀释倍数，t为反应时间，0.1为所取上清液或细胞液的体积。
1.2.4酶活力测定条件的优化
1.2.4.1单因素试验
（1）反应时间的选择
取0.1mL粗酶液与0.2mL5mmol/Lp-NPG（pH值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，在50℃条件下10min、20min、40min,、50min，加入2mL1mol/LNa2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳反应时间。
（2）反应温度的选择
取0.1mL粗酶液与0.2mL5mmol/Lp-NPG（pH值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下反应10min，加入2mL1mol/LNa2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应温度。
（3）缓冲液pH值的选择
取0.1mL粗酶液与0.2mL5mmol/Lp-NPG分别加入pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，分别在50℃条件下反应10min，加入2mL1mol/LNa2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应pH值。
（4）底物浓度的选择
将底物浓度为5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L的p-NPG分别加入pH值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中配制成不同浓度的底物溶液，加入0.1mL粗酶液，分别在50℃条件下反应10min，加入2mL1mol/LNa2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应的底物浓度。
1.2.4.2酶活力测定的正交试验
根据单因素试验结果，选择底物浓度、反应温度、pH值3个因素，每个因素设置5个水平，采用L9（34）正交试验设计，确定β-葡萄糖苷酶的最佳酶活性测定条件，L9（33）正交试验设计水平表见表1。
表1单因素试验选取的不同水平
Table1Levelsofsingle-factortests
试验因素
反应温度/℃
底物浓度/mmol/L
缓冲液pH
水平1
40
5
4.0
水平2
45
10
4.5
水平3
50
20
5.0
水平4
55
30
5.5
水平5
60
40
6.0
1.2.5数据处理统计
用Excel2010软件技术标准误差并制图；用SPSS18.0软件进行Duncan’s多重差异显著分析。
2结果与分析
2.1单因素试验结果分析
2.1.1反应时间对酶活力的影响
由图1可以看出，随着反应时间的延长，酶活力先降低，后趋于平缓。
这是由于当反应体系中酶浓度与底物浓度一定时，随反应的进行，反应速率及酶活力会随着底物浓度的降低而降低；而当底物浓度降低至一定程度后，反应速率及酶活力均较低且趋于稳定[10]。
目前文献中酵母β-葡萄糖苷酶活力测定时间从10min-180min不等[11,12]，反应时间过长导致试验周期延长，效率较低；而反应时间过短时吸光值较小，不符合比色法的要求。
综上所述，选择反应时间为10min进行后续试验。
2.1.2反应温度对酶活力的影响
由图2可知，随反应温度的升高，酶活力先增大后减小，50℃时到达最大值。
这是因为：
一方面，随温度的升高，反应速率随之加快；但当温度过高时，酶的生物活性会受到影响甚至因变性而失去其催化活性，因此酵母β-葡萄糖苷酶活力测定温度普遍较低，从25℃-50℃不等[13]。
后续试验选择反应温度为50℃。
图1反应时间对βG活力的影响图2反应温度对βG活力的影响
Fig.1EffectsofreactiontimeontheactivityofβGFig.2EffectsofreactiontemperatureontheactivityofβG
图3底物浓度对βG活力的影响图4缓冲液对βG活力的影响
Fig.3EffectsofsubstrateconcentrationontheactivityofβGFig.4EffectsofpHvalueontheactivityofβG
2.1.3底物浓度对酶活力的影响
底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素，与酶浓度共同决定反应速度，因此在酶活力测定过程中要求反应底物过量[12]。
目前p-NPG法测定β-葡萄糖苷酶活力过程中的底物浓度不尽相同，酵母来源为1～7mmol/L[14]
本试验以稀释3倍的酶液为试验对象，研究底物浓度对酶活力的影响，结果表明酶活力随底物浓度的增加而增大，当底物浓度较高时，增幅趋于平缓（图3），其中30mmol/L和40mmol/Lp-NPG对酶活力影响不显著（结果未列出）。
考虑到p-NPG价格较为昂贵，因此选择30mmol/L的底物浓度进行后续试验。
2.1.4缓冲液pH值对酶活力的影响
如图4所示，随pH值的增大，酶活力先增大后减小，pH值为5.0时达到最大。
这是因为每种酶都有其各自的最适pH值，在最适pH值时酶催化反应速度达到最大，当pH值过高或过低时都可引起酶的变性失活。
大部分β-葡萄糖苷酶均为酸性蛋白，最适pH值在酸性范围内[15]，酵母β-葡萄糖苷酶测定pH值从4-6不等[7]，本试验中，选择pH值5.0进行后续试验。
2.2正交试验
表2正交试验设计及结果
Table2Designandresultsofexperimenttest
试验号
因素
A反应温度
（℃）
B缓冲液pH值
C底物浓度
mmol/L
酶活力
（U/mL）
1
1（45）
1（4.5）
1（20）
34.43
2
1
2（5.0）
2（30）
37.90
3
1
3（5.5）
3（40）
35.24
4
2（50）
1
3
30.26
5
2
2
1
21.47
6
2
3
2
28.41
7
3（55）
1
2
12.79
8
3
2
3
41.95
9
3
3
1
31.42
k1
29.37
22.90
26.72
k2
33.58
33.93
27.37
k3
28.33
34.47
37.20
R
5.25
11.57
10.48
由表2可知，各因素对酶活力的影响程度为：
B＞C＞A，即反应pH＞底物浓度＞反应温度。
由k值得出最优组合A2B3C3，即40mmol/Lp-NPG溶于pH值5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，50℃反应10min。
2.2.1数据处理统计
用spss18.0统计软件对试验结果进行方差分析，其结果见表3。
表3βG酶活力方差分析
Table1VarianceanalysisforactivityofβG
因素
平方和
自由度
均方
F值
显著性
反应温度/℃
92.547
2
46.274
2.187
缓冲液pH
511.635
2
255.817
12.088
**
底物浓度/mmol/L
413.986
2
206.993
9.781
**
误差
232.791
2
21.163
总和
1250.959
9
注：
*p＜0.05表示显著，**p＜0.01表示极显著。
由表3可知，缓冲液pH值和底物浓度对酶活力均有显著影响，反应温度的影响则不显著。
由于L9（34）正交试验得到的最优组合未在正交表中出现，所以需对正交试验得到的最优组合进行验证试验。
在50℃，缓冲液pH值为5.5，底物浓度为40mmol/L条件下反应10min，重复3次，测得酶活力值为47.58±0.58U/mL，高于正交表中的试验组，因此经方差分析所确定的是最佳测活参数。
3讨论
温度是影响β-葡萄糖苷酶酶活力的主要原因之一，不同的反应温度对酶活力的影响程度不同，本试验中酶活性最高时的酶促反应温度为50℃。
有研究表明，尖孢镰刀菌所产β-葡萄糖苷酶，开始时反应温度升高酶活力升高，当温度升高至50℃酶活达到最大值，随后开始缓慢下降[14]，本试验结果与其测定的结果一致；也有研究表明，葡萄果浆中β-葡萄糖苷酶的活力在反应温度40℃时酶活力达到最大，酶活力在50℃时开始有所下降[15]。
由于本试验所选的酶和文献中的酶的来源存在差异性，因此与上述文献中的温度选择上的差异性。
底物浓度决定酶反应速度，底物浓度增加反应速度增加，当底物浓度增加到一定程度后，反应速度就不受底物浓度的影响而趋于恒定[7]。
从浓度改变的单因素图中（图3）可见当底物浓度从30mmol／L～40mmol／L的过程中酶活力的升高趋于平缓，当达到40mmol／L时酶活力最大达到55.63U／mL。
而在高丽[7]进行的β-葡萄糖苷酶的活性测定方法的研究进展中显示，底物浓度为0.1～10mmol／L；同时在尖孢镰刀菌所产β-葡萄糖苷酶的研究中显示其选用底物浓度为4mmol／L[14]。
但结果证明本试验的酶活性与文献中结果相比，β-葡萄糖苷酶的酶活性高于文献中的相对酶活力。
一般认为是当缓冲液pH值达到最适值时，酶分子中的活性部位最容易与反应底物相结合，不同的缓冲液pH值会直接影响到酶分子的活性，根据试验结果显示当pH值在5.0时酶活力最高为33.77U／mL。
郑芳[16]在一株产β-葡萄糖苷酶生产菌株的分离鉴定及酶学性质研究中表明，当缓冲液的pH值在5.0时β葡萄糖苷酶的酶活力达到最大；同时李华[7]在β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展中也表明缓冲液pH值在5.0时，β-葡萄糖苷酶的酶活力达到最大。
本试验与文献中研究结果一致。
4结论
本试验以酿酒酵母红佳酿酵母为试验对象，研究确定其产β-葡萄糖苷酶的最适测活条件。
在单因素试验的基础上利用正交试验对酿酒酵母红佳酿酵母产β-葡萄糖苷酶的测活条件进行了筛选，确定了其测酶活的最佳条件：
缓冲液pH值5.0；反应时间为10min;反应温度为50℃；底物浓度为40mmol/L，在此条件下红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力最高，达到47.58±0.58U/mL。
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1059～1068
致谢
本论文是在王婧老师的悉心指导下完成的。
她从论文的选题到论文的审阅和定稿都付出了大量的
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