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1、葡萄糖苷酶酶活测定优化本科毕业论文题 目 红佳酿酵母-葡萄糖苷酶酶活测 定条件优化 学 院 食品科学与工程学院 专 业 生物工程 毕业届别 2014届 姓 名 贾 滔 指导教师 王 婧 职 称 副教授 甘肃农业大学教务处制 二一四年六月红佳酿酵母-葡萄糖苷酶的酶活测定条件优化贾滔（甘肃农业大学 食品科学与工程学院 生物工程班 2010级）摘要：以红佳酿酵母菌株为出发菌株，对其-葡萄糖苷酶的酶活性测定条件进行研究。通过单因素试验研究了缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物浓度对-葡萄糖苷酶活力的影响，并采用正交试验确定了最佳酶活测定条件。结果表明：缓冲液pH值5.0；反应时间为10min;反应温

2、度为50；底物浓度为40mmol/L，在此条件下红佳酿酵母-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力最高，达到47.580.58U/mL。关键词：红佳酿；-葡萄糖苷酶；酶活 ;测定方法；优化 To optimize the measurement conditions about enzyme activity of vintage red - glycosidase Jia Tao（Gansu Agricultural University Food science and engineering college Biological engineering class The class of 2010）

3、Abstract: In order to research the measurement conditions about enzyme activity of - glycosidase ，use vintage red strains for test strainsThe effect of buffer pH value，reaction time， temperature and substrate concentration on enzyme activity of - glycosidase was studied by the method of single facto

4、r experiment，and we determines the best conditions for the enzyme activity by applying the orthogonal test The results showed that enzyme activity of Red wine yeast - glycosidase is the highest under the condition of buffer solution pH value was 5.0，reaction time was 10min，temperature was 50 and sub

5、strate concentration was 40mmol/LReached 47.58 0.58U/mL。Key words : Vintage red; -glucosidase; Activity; Determination; Optimization前言-葡萄糖苷酶（-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），全称-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobias，CB或-G）和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的-D-葡萄糖键，同时释放出-D-葡萄糖和相应的配基。1837年，Liebig

6、和 Wohler 首次在苦杏仁中发现-葡萄糖苷酶1，因此苦杏仁成为了-葡萄糖的经典来源。随着现代科学的不断进步，在很多地方都发现-葡萄糖苷酶较普遍的来源是植物的种子和微生物。-葡萄糖苷酶主要用于纤维素的降解2、葡萄酒的增香3等。-葡萄糖苷酶可水解糖苷键合态风味前体物，是葡萄酒风味修饰的关键酶4。葡萄酒中的-葡萄糖苷酶来源于葡萄果实、商品酶制剂（多源于丝状真菌）、酵母（酿酒酵母和非酿酒酵母）和乳酸菌5，其中酵母来源-葡萄糖苷酶在酿造过程中起着重要作用6。因此建立葡萄浆果和葡萄酒中-葡萄糖苷酶活性的快速准确的分析方法，对于增强葡萄酒中的香气和提高葡萄酒的质量意义重大。-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多

7、，常见反应底物有对硝基苯-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性7。但据文献中p-NPG法测酶活力时所用的反应时间、反应温度、反应pH和底物浓度等条件各不相同，因此不同来源-葡萄糖苷酶酶学性质有较大差异，导致酶活力定义有所不同，使得各文献中菌株酶活力的大小难以比较7。本试验采用国内目前葡萄酒产业普遍应用的商业酿酒酵母中胞外酶活较高的菌种之一红佳酿酵母菌（VR），对其所产的-葡萄糖苷酶的测活条件进行优化。通过单因素及正交试验优化酶活

8、力测定条件，旨在为统一酵母来源-葡萄糖苷酶活力测定方法，促进高产菌株筛选及其产酶条件的研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试菌株商品酵母：Vintage Red(VR)，意大利Enartis公司。 1.1.2 主要药品p-NPG(4-Nitrophenyl -D-glucopyranoside，纯度98%)，美国Sigma公司；蛋白胨，酵母浸粉 购自北京奥博星生物技术有限责任公司；对硝基苯酚（p-NP）购自天津市凯信化学工业有限公司；葡萄糖，无水磷酸氢二钠，柠檬酸，无水碳酸钠等均为国产分析纯。1.1.3 供试培养基 YPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L

9、，酵母浸粉10g/L，超纯水，pH5.0；121灭菌20min。产酶（发酵）培养基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，NH4NO3 0.3%, KH2PO4 0.4%,121，灭菌20min, 在温度降为70左右加入0.1% 对硝基苯酚-D葡萄糖苷 ( p-NPG)。 1.1.4 主要仪器与设备CP214电子天平 (上海奥豪斯仪器有限公司)；HH-S型恒温水浴锅 （金坛市恒丰仪器制造有限公司）；Genesis 10s紫外可见分光光度计 (美国Thermo Scientific公司)；GZX-GF101-电热恒温鼓风干燥箱 (上海跃进医疗器械有限公司)；18100摩尔超纯水机 (

10、重庆摩尔水处理设备有限公司)；H2050R台式高速冷冻离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司)；NRY-200空气恒温摇床 (上海南荣实验室设备有限公司)；SW-CJ-2FD洁净工作台 (苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；SPX-150-生化培养箱 (上海跃进医疗器械有限公司）；1.2 试验方法 1.2.1 菌株活化按推荐用量（0.2g/L）称取5保存的供试商品活性干酵母（红佳酿），接种至50倍体积的YPD液体培养基中，37活化20min。 1.2.2 粗酶液的制备活化后的菌株按10%接种量接种至装有50mL(250mL三角瓶)的发酵培养基中，28，180r/min，摇床培养48h，将发酵液8

11、000r/min离心10min，去除沉淀，收集上清液即为粗酶液。试验重复3次。 1.2.3 -葡萄糖苷酶活力的测定1.2.3.1 标准曲线绘制称取对硝基苯酚139.0mg，用蒸馏水定容至1000mL，分别吸取该溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于100mL容量瓶中，用1mol/L Na2CO3溶液定容后混匀。以蒸馏水作为空白，于400nm处测其吸光值。以p-NP溶液浓度（g/mL）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线方程，得线性回归方程、相关系数分别为：y=19.882x+0.0017，R2=0.9991，n=5。 1.2.3.2 -葡萄糖苷酶活力

12、性测定胞外酶：取100L上清液，加入200L p-NPG（5mmol/L溶于pH值5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，P-C缓冲液）混匀，50反应30min，立即加入2mL 1mol/L Na2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值8。摩尔消光系数为：=18300M-1cm-19-葡萄糖苷酶酶活力单位（U）定义为：在pH5.0，50反应条件下， 1毫升酶液1分钟水解p-NPG 产生 p-NP的量（nmol）为一个酶活单位（U） 1.2.3.3 酶活力计算式中：U为酶活力单位（U/mL），c为对硝基苯酚的浓度，V为反应体系的体积，N为原酶液稀释倍数，t为反应时间，0.1为所取上清液或细胞

13、液的体积。1.2.4 酶活力测定条件的优化1.2.4.1 单因素试验(1) 反应时间的选择取 0.1mL 粗酶液与 0.2mL 5mmol/L p-NPG（pH值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，在50条件下10min、 20min、40min,、50min，加入2mL 1mol/L Na2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳反应时间。(2) 反应温度的选择取 0.1mL 粗酶液与 0.2mL 5mmol/L p-NPG（pH值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，分别在40、45、50、55、60条件下反应10min，加入2mL 1mol

14、/L Na2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应温度。(3) 缓冲液pH值的选择取 0.1mL 粗酶液与 0.2mL 5mmol/L p-NPG分别加入pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，分别在50条件下反应10min，加入2mL 1mol/L Na2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应pH值。(4) 底物浓度的选择将底物浓度为5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L的p-NPG分别加入pH值5.0的柠檬酸

15、-磷酸盐缓冲液中配制成不同浓度的底物溶液，加入0.1mL粗酶液，分别在50条件下反应10min，加入2mL 1mol/L Na2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应的底物浓度。1.2.4.2 酶活力测定的正交试验根据单因素试验结果，选择底物浓度、反应温度、pH值3个因素，每个因素设置5个水平，采用L9(34)正交试验设计，确定-葡萄糖苷酶的最佳酶活性测定条件，L9(33)正交试验设计水平表见表1。表 1 单因素试验选取的不同水平 Table 1 Levels of single-factor tests 试验因素 反应温度/底物浓度/mmo

16、l/L缓冲液pH水平1 4054.0水平2 45104.5水平3 50205.0水平4 55305.5水平5 60406.01.2.5 数据处理统计用Excel2010软件技术标准误差并制图；用SPSS18.0软件进行Duncans多重差异显著分析。2 结果与分析 2.1 单因素试验结果分析 2.1.1 反应时间对酶活力的影响由图1可以看出，随着反应时间的延长，酶活力先降低，后趋于平缓。这是由于当反应体系中酶浓度与底物浓度一定时，随反应的进行，反应速率及酶活力会随着底物浓度的降低而降低；而当底物浓度降低至一定程度后，反应速率及酶活力均较低且趋于稳定10。目前文献中酵母-葡萄糖苷酶活力测定时间从

17、10min-180min不等11,12，反应时间过长导致试验周期延长，效率较低；而反应时间过短时吸光值较小，不符合比色法的要求。综上所述，选择反应时间为10min进行后续试验。 2.1.2 反应温度对酶活力的影响由图2可知，随反应温度的升高，酶活力先增大后减小，50时到达最大值。这是因为：一方面，随温度的升高，反应速率随之加快；但当温度过高时，酶的生物活性会受到影响甚至因变性而失去其催化活性，因此酵母-葡萄糖苷酶活力测定温度普遍较低，从25-50不等13。后续试验选择反应温度为50。 图1 反应时间对G活力的影响 图2 反应温度对G活力的影响Fig.1 Effects of reaction

18、time on the activity of G Fig.2 Effects of reaction temperature on the activity of G 图3 底物浓度对G活力的影响 图4 缓冲液对G活力的影响 Fig.3 Effects of substrate concentration on the activity of G Fig.4 Effects of pH value on the activity of G 2.1.3 底物浓度对酶活力的影响底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素，与酶浓度共同决定反应速度，因此在酶活力测定过程中要求反应底物过量12。目前p-N

19、PG法测定-葡萄糖苷酶活力过程中的底物浓度不尽相同，酵母来源为17mmol/L14本试验以稀释3倍的酶液为试验对象，研究底物浓度对酶活力的影响，结果表明酶活力随底物浓度的增加而增大，当底物浓度较高时，增幅趋于平缓（图3），其中30 mmol/L和40mmol/L p-NPG对酶活力影响不显著（结果未列出）。考虑到p-NPG价格较为昂贵，因此选择30mmol/L的底物浓度进行后续试验。 2.1.4 缓冲液pH值对酶活力的影响如图4所示，随pH值的增大，酶活力先增大后减小，pH值为5.0时达到最大。这是因为每种酶都有其各自的最适pH值，在最适pH值时酶催化反应速度达到最大，当pH值过高或过低时都可

20、引起酶的变性失活。大部分-葡萄糖苷酶均为酸性蛋白，最适pH值在酸性范围内15，酵母-葡萄糖苷酶测定pH值从4-6不等7，本试验中，选择pH值5.0进行后续试验。2.2 正交试验表 2 正交试验设计及结果Table 2 Design and results of experiment test试验号因素A反应温度（）B缓冲液pH值C底物浓度mmol/L酶活力（U/mL）11(45)1(4.5)1(20)34.43212(5.0)2(30)37.90313(5.5)3(40)35.2442(50)1330.26522121.47623228.4173(55)1212.79832341.959331

21、31.42k129.3722.9026.72k233.5833.9327.37k328.3334.4737.20R5.2511.5710.48由表2可知，各因素对酶活力的影响程度为： BCA，即反应pH底物浓度反应温度。由k值得出最优组合A2B3C3，即40mmol/Lp-NPG溶于pH值5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，50反应10min。2.2.1 数据处理统计用spss18.0统计软件对试验结果进行方差分析，其结果见表3。表 3 G酶活力方差分析Table 1 Variance analysis for activity of G因素平方和自由度均方F值显著性反应温度/92.5472

22、46.2742.187缓冲液pH511.6352255.81712.088 *底物浓度/mmol/L413.9862206.9939.781*误差232.791221.163总和1250.9599注：*p0.05表示显著，*p0.01表示极显著。由表3可知，缓冲液pH值和底物浓度对酶活力均有显著影响，反应温度的影响则不显著。由于L9(34)正交试验得到的最优组合未在正交表中出现，所以需对正交试验得到的最优组合进行验证试验。在50，缓冲液pH值为5.5，底物浓度为40 mmol/L条件下反应10min，重复3次，测得酶活力值为47.580.58U/mL，高于正交表中的试验组，因此经方差分析所确定

23、的是最佳测活参数。3 讨论 温度是影响-葡萄糖苷酶酶活力的主要原因之一，不同的反应温度对酶活力的影响程度不同，本试验中酶活性最高时的酶促反应温度为50。有研究表明，尖孢镰刀菌所产-葡萄糖苷酶，开始时反应温度升高酶活力升高，当温度升高至50酶活达到最大值，随后开始缓慢下降 14，本试验结果与其测定的结果一致；也有研究表明，葡萄果浆中-葡萄糖苷酶的活力在反应温度40时酶活力达到最大，酶活力在50时开始有所下降15。由于本试验所选的酶和文献中的酶的来源存在差异性，因此与上述文献中的温度选择上的差异性。底物浓度决定酶反应速度，底物浓度增加反应速度增加，当底物浓度增加到一定程度后，反应速度就不受底物浓度

24、的影响而趋于恒定7。从浓度改变的单因素图中（图3）可见当底物浓度从30mmolL40mmolL的过程中酶活力的升高趋于平缓，当达到40mmolL时酶活力最大达到55.63UmL。而在高丽7进行的-葡萄糖苷酶的活性测定方法的研究进展中显示，底物浓度为0.110mmolL；同时在尖孢镰刀菌所产-葡萄糖苷酶的研究中显示其选用底物浓度为4mmolL14。但结果证明本试验的酶活性与文献中结果相比，-葡萄糖苷酶的酶活性高于文献中的相对酶活力。一般认为是当缓冲液pH值达到最适值时，酶分子中的活性部位最容易与反应底物相结合，不同的缓冲液pH值会直接影响到酶分子的活性，根据试验结果显示当pH值在5.0时酶活力最

25、高为33.77UmL。郑芳16在一株产-葡萄糖苷酶生产菌株的分离鉴定及酶学性质研究中表明，当缓冲液的pH值在5.0时葡萄糖苷酶的酶活力达到最大；同时李华7在-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展中也表明缓冲液pH值在5.0时，-葡萄糖苷酶的酶活力达到最大。本试验与文献中研究结果一致。4 结论 本试验以酿酒酵母红佳酿酵母为试验对象，研究确定其产-葡萄糖苷酶的最适测活条件。在单因素试验的基础上利用正交试验对酿酒酵母红佳酿酵母产-葡萄糖苷酶的测活条件进行了筛选，确定了其测酶活的最佳条件：缓冲液pH值5.0；反应时间为10min;反应温度为50；底物浓度为40mmol/L，在此条件下红佳酿酵母-葡萄糖苷酶

26、粗酶液的酶活力最高，达到47.580.58U/mL。参 考 文 献1 Lymar E S，Li B，Renganthan VPurification and characterization of a cellulose-binding -glucosidase from cellulose degrading cultures of Phanerochaete chrysosporiumJ. Applied Environment Microbiology,1995,61(8)： 287619802 姚卫蓉,丁霄霖.1998.p-NPG法测定纤维素酶系中-葡萄糖苷酶J.微生物学通报,25：1

27、82 1833 翦袆.红佳酿酵母产-葡萄糖苷酶条件优化及酶学性质研究D.甘肃农业大学.2013 4 康文怀, 徐岩, 赵光鳌. 葡萄酒风味修饰研究进展J.食品与生物技术学报,2009,28(4):438-4435 Palmeri R, Spagna G.-Glucosidase in cellular and acellular form for winemaking applicationJ.Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40(3):382-3896 Lepe J A, Morata A. New trends in yeast selecti

28、on for winemaking J.Trends in Food Science & Technology, 2012, 23(1):39-57 李华,高丽.2007.-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展J.食品科学,27：1821858 王玉霞.阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）-葡萄糖苷酶及葡萄糖苷类风味物质水解机制的研究D.江南大学.20129 Blondin B, Ratomahenina R, Arnaud A,et al. Purification and properties of the -glucosidase of a yeast capable of

29、 fermenting cellobiose to ethanol: Dekkera intermedia van der waltJ. European journal of applied microbiology and biotechnology, 1983, 17(1):1-610 郭勇. 酶工程(第3版)M .北京:科学出版社,2009:11 万振堂, 杨丽杰. 产胞外-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选及其酶学性质的初步研究J.食品与发酵工业,2009,35(4):28-3212 李庆华. 产-葡萄糖苷酶菌株的筛选及酶活的研究D. 西北农林科技大学.200913 李平,宛晓春,丁霄霖,陶文沂.1998.黑曲霉-葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质研究J. 安徽农业大学学报,25:30430914 车健美,刘波,朱育菁,蓝江林,林抗美,肖荣风.2006.尖孢镰刀菌中-D-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究J.江西农业大学学报,28:12612815 李华,高丽.2007.葡萄浆果中-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究J.酿酒科技,8：14614916 郑芳,曹小芳,张亚玲.2012.一株-葡萄糖苷酶生产菌株的分离鉴定及酶学性质的研究 J.微生物学通报.39(8): 10591068 致 谢本论文是在王婧老师的悉心指导下完成的。她从论文的选题到论文的审阅和定稿都付出了大量的