体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新.docx

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体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

ChinaBiotechnology,2011,31（3）:

91-中国生物工程杂志

96

体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

12431511吕蓓程海荣严庆丰黄震巨李轶女罗达沈桂芳张志芳

1*21程奇邓子新林敏

（11000832中国农业科学院生物技术研究所北京上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢教育部重点实验室上海200240）（331510043100585510275）浙江泰晶生物科技有限公司宁波浙江大学生命科学院杭州中山大学生命科学院广州

1983（PCR）摘要利用聚合酶链式反应进行的核酸体外扩增是年开始发展起来的一项革命性技,,术目前已被广泛运用于现代化的农业和医学以及食品工业等领域特别是在人类认知基因和基因

。

组的过程中体外核酸扩增技术做出了卓越的贡献最初体外核酸扩增技术主要是利用耐高温的DNA（Taq）,。

聚合酶酶这样就使核酸的体外扩增反应可以在热循环中进行但因需要使用昂贵的设

。

,备和消耗大量的电力其成本和应用范围都受到一定的限制之后恒温体外核酸扩增悄然兴起这

。

（RAA）改变了传统扩增技术的局限性使核酸的体外扩增更加简单和方便重组酶介导扩增法是一

DNA种最新型的恒温体外核酸扩增技术该系统的显著优点在于它在常温下就能实现解链并快速（15:

30min）,、、,。

扩增完成反应快速专一性好灵敏度高还可用于定时定量的结果分析

关键词重组酶介导核酸体外扩增恒温

Q784中图分类号

。

人类几千年的文明史发展至今其实也是一个科打开如今人类已经对地球上几乎所有生命的基因组

20。

,学技术发展的过程这在世纪尤为突出其中生物都开始着手分析至今有近万个全基因组序列覆盖了30,,、、

（1）。

技术近年的发展经历了史无前例的飞跃现代生微生物植物动物以及人类自身表这就为将生

。

物技术已经渗透到了人们衣食住行的每一环节对核物技术彻底运用于现代化的农业和医学以及食品工业

10。

酸和蛋白质大分子的研究从发现到认识和利用的过年里全基因等相关行业铺平了道路相信在未来

21,,。

程也是飞速惊人甚至有时会远远超出人类的想象组的资源将以指数级速度增长预计到世纪末一

1953WatsonCrick。

些全功能基因组分析也将完成年美国人和英国人率先向世人展示

DNA,了双螺旋结构模型地球上生命之谜的大门从此

1表几大类基因组资源

Table1GenomeResources

基因组资源

Eukaryotic//www,ncbi,nlm,nih,gov/genomes/leuks,cgihttp:

真核生物类Fungihttp:

//www,ncbi,nlm,nih,gov/genomes/leuks,cgi?

p3=11:

Fungi,taxgroup=11:

Fungi|12:

真菌类Insectshttp:

//www,ncbi,nlm,nih,gov/genomes/leuks,cgi?

p3=12:

Insects,taxgroup=11:

|12:

Insects昆虫类Mammalshttp:

//www,ncbi,nlm,nih,gov/genomes/leuks,cgi?

p3=12:

Mammals,taxgroup=11:

|12:

Mammals哺乳类http:

//www,ncbi,nlm,nih,gov/genomes/MCROBES/microbial_taxtree,htmlIMicrobial微生物类ViralResources病毒资源nfuenzarusIlVihttp:

//www,ncbi,nlm,nih,gov/genomes/FLU/FLU,html流感病毒Retroviruseshttp:

//www,ncbi,nlm,nih,gov/retroviruses/逆转录酶病毒ViralGenomeshttp:

//www,ncbi,nlm,nih,gov/genomes/GenomesHome,cgi?

taxid=10239病毒基因组

WatsonCrick。

蛋白质是生命活动的表达物质基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序列继和第一次DNA,揭示了的双螺旋结构之后许多科学家又发现了2010-11-112011-01-04:

:

收稿日期修回日期。

1983能专一识别核酸序列的各类酶而在年人类第*,:

chengqi@caa,snet,cn通讯作者电子信箱

DNA,Korana。

PCR一次能够在体外扩增之后对核酸的操作和利用地实现了提出的核酸体外扩增的设想技

,,进入了一个革命性的阶段直到现在体外核酸扩增技术无疑给分子生物学带来了革命它使扩增和克隆基

。

DNA、术仍在不断地改进和完善因成为常规操作程序也为指纹鉴定亲子和亲缘

关系的鉴定和那些遗传和病原菌引起的疾病的诊断成为1核酸扩增技术的迅速发展。

20PCR,可能多年来技术在高效高保真方面都得到了

1,1PCRT-PCR（）、,R技术的出现半定量全面的发展和完善后来还出现了

206070Real-timePCR（、-PCRqPCR）。

世纪年代末年代初人们开始致力于研究定量跟踪免疫和等

orana1971PCR,K,DNA于年最早提出核酸通过技术特定序列的分子可以实现指基因的体外分离技术

:

“DNA,体外扩增的设想经过变性与合适的引物数级别的扩增从原来的少量分子扩增到可以用仪器,DNA,,杂交在聚合酶的作用下将引物延伸并不断重检测的水平利用这一特点可以对一些特异的病原或

tRNA”。

复该过程便可克隆基因这个设想在理论上疾病标志物进行诊断现在已被广泛应用于疾病检测

DNA,。

PCR是完全可以实现的首先高温可以使双链打开和诊断等各个领域常规的技术由于热循环的需

PCR,,要使这一技术完全依赖于电源和昂贵的仪器从再在降温退火的过程中使两端的同源引物配对然

。

DNA。

DNA而限制了这一技术在实验室之外的应用由于上述缺后由聚合酶延伸合成新生的链但变性需

,,PCR要高温而通常情况下任何酶在高温下都会完全失点科学界一直在试图发展不需要使用仪器的核,Korana,去活性因此的创造性想法一直未能得以实酸扩增方法常温或恒温核酸扩增技术的发展成为一

。

1983KaryMullis（PE-。

现直到年一个叫的美国人个不可逆转的趋势

1,2Cetus）,PCR公司人类遗传研究室在从著名的黄石公园度恒温技术的兴起

PCR假回来的路上他的灵感忽然让他想到了一个能使双由于传统始终受仪器设备和电力以及空间等DNA。

。

PCR链从一个变成多个乃至大量拷贝的方法这个诸多因素的限制近年来恒温技术已经开始悄然

（2）。

（polymerasechainreaction,10,方法就是聚合酶链式反应兴起表在过去年中若干恒温核酸扩增技术

1,PCR）。

PCRMullis,SDA、TMA、HDA、反应的关键就在于找到了可以在得到快速发展如技术技术技术

2-9,DNA（TaqDNA）,LAMP/RAA。

RPA高温下不会变性的聚合酶聚合酶并技术和技术等

2表几种恒温核酸扩增技术缩写列表用这个酶完美

Table2Theabbreviationofisothermalnucleicacidamplificationmethods

缩写名称中文名称TMATranscrpton-medatedampfcatoniiiliii转录介导扩增法NASBANucleicacidsequence-baseadmplification核酸序列扩增法SDAStrandidsplacementamplification链置换扩增法HDAHelicase-dependentisothermalDNAamplification解旋酶恒温基因扩增法LAMPLoop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增法RCARollingcircleamplification滚环扩增法RecombinasepolymeraseamplificationRPA重组酶聚合酶扩增法RAARecombnase-adampfcatoniiliii重组酶介导扩增法

PA/RAA（3）。

LAMPR在这几种技术中技术和技术是相对比较成熟的技术表

3表几种恒温核酸扩增技术的性能比较

hefunctionofdffeensohemancecacdampfcaonmehodsTirtitrluliiliititTable3

TMASDAHDALAMPRCARPA/RAA

+N/K-N/AN/K+超稳定性N/K--N/AN/K+无需温控操作（min）2030-4030-60,60,25,15速度RNA++DNARNADNA/RNA模板/++-+-+多重扩增反应探针++--++灵敏度//-N/----+热冷可操作性A--+++模板复杂性-++--+定量跟踪操作

:

+:

;-:

;N/A:

;N/K:

注好不好无未。

知

932011,31（3）:

吕蓓等体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

LAMP4:

6,6。

技术需要使用个引物在使用个引荧光蛋白的帮助该系统的显著优点在于它在常温下,20:

30min。

LAMP:

30min）。

DNA（15物的时候反应可以在完成反应需内完成就能实现解链并快速扩增

65?

。

要在下进行通过类似于滚环复制的链替换反RPADNAPCR所以扩增技术就免去了使用贵重的仪

。

。

应可以生成一系列分子质量大小不同的扩增产物器而且也不受样品槽孔多少和空间的限制国际上

22-24,,BstDNA,。

其优点在于只需要使用一个聚合酶该酶可已经有三个公司分别各有一个类似技术的专利

RPAT4,SSB65?

DNA,技术主要利用一个重组酶的活性在以在恒温的条件下使在体外扩增且其反应

DNA,,,和重组酶的辅助下不进行核酸解链和退火即组分可以在室温稳定地保存若干星期这为其用于野

10,37?

。

。

LAMP可在进行核酸的扩增由于重组酶的特性所使外诊断提供了便利反应的灵敏度高于传统

11-15,30bp。

PCR,PCR,用的两个引物长度需大于其优点在于反应可的高温与巢式反应的灵敏度相似并

16-18,,PCR,且反应的结果特异可靠还可以用于未纯化的样以生成和一致的单一条带可以直接测序或用于

19,。

LAMP品通过使用荧光染料反应的结果可以直;,PCR连接到载体上引物设计简单除长度外和引物设

。

LAMP接用肉眼观测或使用荧光计进行定量当然技;,37?

;计一致反应温度低可以在进行反应反应速度

,,,20:

30min;,术也存在一些不可忽视的缺点首先引物设计复杂快在即可完成利用荧光标记的探针还可

。

,;需要使用特殊的软件其次引物个数多并且由于其以实现实时定量的结果分析同时也可以使用生物素PCR,LAMP反应原理和完全不同反应得到的产物是。

标记的引物配合胶体金试纸条进行结果检测另外

一系列大小不同的扩增片段无法直接进行测序和克,在冻干粉保存的情况下其反应组分可以在室温下

长,。

隆只能用于判断是否存在目的模板最后使用嵌入

。

时间稳定保存其缺点在于虽然扩增结果和引物二聚式的荧光染料进行定量扩增的时候不可避免有假阳性

体可以在凝胶电泳照片上得到清晰分辨然而可能的。

的问题

;引物二聚体会造成较高的荧光或胶体金假阳性同时LAMP,,尽管技术存在一些不足但在国际上该技

由于反应体系中蛋白质含量高扩增结果需要先纯化术已被成功应用在分子诊断和微生物病毒检测等领

。

或进行酚抽提之后才能进行琼脂糖凝胶电泳。

IS6110域例如根据结核菌的保守序列设计的

RAArecA技术采用的是来自于大肠杆菌的重组LAMP,DNA引物可在样品中检测到痕量的结核菌片

recADNA,酶重组酶可以与紧密结合并与引物形成,100%,段结核菌检测的正确率能达到且在检测结核

DNA,聚合体扫描双链在与引物同源的序列处使双链,LAMPPCR菌的灵敏度方面技术与巢式的灵敏度相

20,DNA。

SSBDNA,解旋在和聚合酶的共同作用下新的,PCR20。

同但比传统技术的灵敏度高约倍

DNA。

片段可以在体外快速地扩增出来这个体外LAMP,目前国内对技术也已经有所应用如上海

DNA,37?

:

15扩增的过程不需要高温一般在反应LAMP/HBVHIV血液中心发展了用技术进行血液筛查,25,30minPCR。

即可得到与传统高温相同的目的片段。

等方法并申请了国家专利广州华峰生物公司也申请

RAA（在国内技术已经申报了专利浙江泰晶生物LAMP,了一系列的相关技术的专利用于食物中毒的

）,,科技有限公司结合其他各种优秀技术可以使底物,、一系列相关病原的检测如李斯特菌沙门氏菌以及大

21,、,检测扩展到核酸蛋白质和糖类化合物并以此为基础O:

157。

肠杆菌等

开发出独一无二的系列快速诊断试剂产品扩大体外

2RPA/RAA—常温核酸扩增的创新技术。

RAA核酸扩增的应用范围相信以技术为基础的各

类核酸快速高效扩增产品将为人类健康和农业植物,T4最近使用的常温核酸扩增技术以利用噬菌体

病虫害的防治提供及时的诊断和防治以其优势取代DNA,DNA复制机理系统最为成功在扩增技术方面这

PCR,部分或补充技术所拥有的市场并作为一种不断（recombnasei项新的发明叫重组酶聚合酶扩增法

完善的分子生物学工具在研究和应用上发挥更大的polymeraseamplification,RPA）。

RPA,在系统中除需

。

作用DNA,T4要一种常温下能工作的聚合酶外还包含一个3结语DNA（snge-strandedDNAil重组酶和一个单链结合酶

binding,SSB）,DNA。

以及另一个辅助重组酶的蛋白PCR,RAA和传统的技术相比核酸扩增技术无疑

。

Real-timePCR,是一个升级换代版本它的意义不仅是缩短了核酸扩如果效仿利用简易的荧光仪还需一个

（PCR。

RAA增的反应时间重要的是它摆脱了仪器装置的束缚图仪器的便捷性的市场机会技术不依赖于1）。

PCR94?

,DNA技术的原理是利用高温使双链解能是革命性的技术突破能充分扩大核酸扩增技术的,DNA（Taq）。

RAA,旋并在耐高温的聚合酶的作用下扩增应用领域此外技术还能完成多重引物扩增配DNA。

PCR,RAA,片段反应通常设定三个不同的温度使特异合荧光仪可形成一套多重荧光实时检测系统DNA。

RAA,性片段得到指数递增技术则不需要通过即利用不同颜色的荧光标记在同一个反应里检测到

DNA,,,高温使双链解旋而是利用重组酶结合引物后不同的目的基因这是其他恒温核酸扩增技术或巢式

DNA,DNAPCR。

在引物识别位点侵入模板双链在单链结合技术无法相比的特点

DNA,RAA、,RAA蛋白的帮助下以及在适当的聚合酶的作用下随着技术的进一步深化完善在技术

DNA（15:

30min）的基础上可以很快地研发出适合家庭使用的分子诊断也使目的片段在短时间内得到指数

。

RAA,,,级积累在反应体系中由于重组酶的作用不试剂使全国乃至全球对病毒性和遗传性疾病的定期

DNA,。

需要高温即可在引物识别位点使模板解旋从而和快速普查在技术上成为可能这将是一个非常巨大

PCR,。

省去了传统反应中三个温度的循环节约了时间的潜在市场其经济意义不可估量结合其他优秀技

。

-RAA,并减少了能源的消耗术如发展免疫可使检测对象从核酸扩大到蛋白

、。

RAA质糖类或其他大分子化合物同时技术也可作

为一种基础的研究手段进一步促进分子生物学的研

。

RAA究技术极有可能帮助功能基因组学和植物分子

生物学获得突破性进展进而形成更加巨大的生物

科

。

技产业

核酸扩增新技术的出现将带动与之相关的仪器设

、,备配套试剂等新产业的发展甚至会影响到人们的日

。

常生活在物联网飞速发展的今天基于先进技术的

核酸体外分子检测可以帮助人们足不出户即可完成某

,些疾病的检测和诊断特别是行动不便的患者或需要1PCRRAA图和技术的原理对比图。

隔离的传染性疾病疑似患者将从中获益在我国发展Fig,1ThecomparativeflowchartofPCR

andRAAtechniques:

恒温核酸体外扩增新技术的意义在于第一可以继续

;,处于世界领先的位置第二满足我们国家节能减排的由于恒温核酸扩增技术只需要一个小型的恒温装;,。

发展战略的需要第三服务于更多的人民群众随着

置就可以进行核酸的指数扩增这使得发展一种利用21,世纪科学技术的进步和国家的逐步重视特别在国

LED锂电池和紫外的便携式的小型核酸扩增仪以及相“”,家十二五期间对相关领域的高度重视核酸体

。

关的检测装置成为可能利用这一技术可以在非外扩增技术及其相关产业将会迎来一个快速发展的时参考文献。

实验室的环境下进行快速核酸扩增检测发展这一。

期

技,1,GillP,GhaemiA,Nucleicacidisothermalamplification

technologies:

areview,Nucleosides,nucleotides,nucleic,（术对于我国目前形势严峻的传染性疾病检测如甲型

acids,2008,27:

224-243,HNSARS,）流感甚至是等传染性疾病具有重大11,2,GuatelliJC,WhitfieldKM,KwohDY,etal,sothermal,nIi。

的意义vtroampfcatonofnucecacdsbyamutenzymereactoniliiiliiliiRAA技术的优势使其有望在很大程度上代替传统modeledafterretroviralreplication,ProceedingsoftheNationalPCR。

PCR的技术由于传统的技术受仪器和空间的限AcademyoSfciencesoftheUnitedStatesoAfmerica,1990,87:

制使得现有核酸扩增技术的应用价值没有被充分挖1874-1878,

。

PCR,,掘出来例如目前仅肝炎检测一个项目试剂的,3,ComptonJ,Nucleicacidsequence-baseadmplification,Nature,

1,5,国内市场容量就达亿元因为受到检测费用的限1991,350:

91?

C92,

4,WalkerGT,LittleMC,NadeauJ,Getal,Isothermalinvitro,PCR30%。

制检测还只占整个肝炎检测市场的如果

RAA,技术能充分克服费用昂贵的限制将会有更大

952011,31（3）:

吕蓓等体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新

amplificationofDNAbyarestrictionenzyme/DNApolymeraseSensitiveandrapiddetectionofinfectionbyloop-mediated

system,ProceedingsoftheNationalAcademyoSfciencesoftheisothermalamplification（LAMP）method,Experimental

UnitedStatesoAfmerica,1992a,89:

392-396,parasitology,2009,122

（1）:

47-50,,5,WalkerGT,FraiserMS,SchramJ,Letal,Strandidsplacement,16,onoT,SavanR,SakaM,eta,DetectonofwhtespotKilii

amplification--anisothermal,invitroDNAamplificationsyndromevirusinshrimpbyloop-mediatedisothermaltechnique,Nucleicacidsresearch,1992b,20,1691-1696,amplification,Journalofvirologicalmethods,2004,115:

59-65,,6,VincentM,XuY,Kon