流式细胞仪检测细胞周期操作步骤学习资料.docx

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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤学习资料

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

取对数生长期的A549细胞，按1×106cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内

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24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）

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特定时间后终止培养，进行下一步的实验

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收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中

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1000rpm离心5min（短时低速离心）

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弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片

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加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。

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1000r/min,离心5min

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将乙醇吸除，加PBS清洗混匀

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1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去

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吸除离心管内PBS，加入200ulPBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）（37℃下孵育30min）

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加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min

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将离心管内的细胞过滤（300um尼龙网膜）至含有PBS的EP管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管

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开机（先开仪器后开软件）

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流式细胞仪的结构一般分为5部分：

①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。

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检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上

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流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱

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液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）

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荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）

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在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出

结果分析——Modfit软件分析

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