分子生物学实验手册handbook.docx

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分子生物学实验手册handbook

分子生物学技术

实验手册

高雄医学院生物学系

游仲逸、张永福编着

目   录

实验一：

GenomicDNA的制备

实验二：

TotalRNA的制备

实验三：

聚合脢连锁反应

实验四：

DNA选殖

实验五：

基因转型

实验六：

质体DNA的少量制备和限制脢切割分析

实验七：

DNA定序分析

实验八：

北方点墨分析

实验九：

在大肠杆菌内大量表现重组蛋白

实验一：

GenomicDNA的制备

实验目的

纯化genomicDNA是一系列DNA分析，如南方点墨法（Southernblotting），聚合脢连锁反应（polymerasechainreaction,PCR），基因组库（genomiclibrary）之建构及筛选等的前置步骤。

本实验将从你所选定之动物组织或细胞中抽取genomicDNA。

你将从本实验中学习如何自细胞或组织中萃取并纯化genomicDNA。

实验原理

本实验是以动物组织或细胞作为genomicDNA的来源。

先以阴离子性清洁剂如sodiumdodecylsulfate（SDS）将细胞打破，并使蛋白质变性，以抑制DNase的活性，也让DNA上的蛋白质解离。

同时加入高浓度的ethylenediaminetetraaceticacid（EDTA）亦可抑制DNase的活性。

另外以RNase除去RNA。

而蛋白质则不以有机溶剂如phenol来萃取掉，而是以盐类沉淀方法去除。

如此可避免使用具毒性之有机溶剂，而DNA亦较不会断裂。

萃取到的genomicDNA以酒精沉淀法浓缩，并回溶于TE缓冲溶液中保留。

最后，测波长260nm与280nm之吸光值，以计算所抽出DNA之浓度与纯度。

纯DNA的A260/A280比值约为1.8，比值太低时，表示蛋白质残留太多。

DNA浓度计算方式为OD260=1时，DNA浓度约为50μg/ml。

实验材料

∙RBClysissolution：

ammoniumchloride,EDTA,sodiumbicarbonate

∙Celllysissolution：

10mMTris-HCl（pH8.0）,100mMEDTA,0.5%SDS

∙RNaseAsolution：

4mg/mlRNaseA

∙Proteinprecipitationsolution：

10Mammoniumacetate

∙Isopropanol

∙70%ethanol

∙TE缓冲溶液：

10mMTris-HCl,pH8.0,1mMEDTA

实验步骤

1. 首先要将细胞溶解，不同材料之处理方式略有差别。

a） 若为全血，则取300μl于微量离心管内，加入900μlRBClysissolution，上下颠倒摇动使其混合，于室温培养10分钟，培养期间再颠倒摇动一次。

于12,000rpm离心20秒，以微量吸管吸去上清液，留下白血球沉淀及约10-20μl的残留液。

剧烈震荡，使沉淀细胞回溶于残留液内。

加入300μlcelllysissolution，并以微量吸管吸冲多次，使细胞溶解，若细胞无法完全溶解，则将其培养于37oC中至完全溶解为止。

b） 若为动物组织，则取约10-20mg于微量离心管内，加入600μl预先冰过之celllysissolution，立即以研磨棒研磨30-50下。

于65oC培养15-60分钟，使组织溶解。

（若要提高DNA的产量，则可改加3μl20mg/mlproteinaseKsolution，然后于55oC培养3-12小时。

）

2. 加入1.5μl（全血）或3μl（动物组织）RNaseAsolution，上下颠倒摇动25次后培养于37oC中15-60分钟。

3. 将样品冷却至室温。

加入100μl（全血）或200μl（动物组织）proteinprecipitationsolution。

剧烈震荡20秒使其完全混合。

于12,000rpm离心3分钟，蛋白质会形成深褐色致密沉淀。

4. 将含有DNA的上清液倒入另一个微量离心管，并加入300μl（全血）或600μl（动物组织）100%isopropanol。

上下颠倒摇动50次后，会产生白色的DNA细丝。

于12,000rpm离心1分钟，可看到白色的DNA沉淀。

将上清液倒掉，并在卫生纸上吸干残液。

加入300μl（全血）或600μl（动物组织）70%ethanol，上下颠倒摇动数次以清洗DNA沉淀。

于12,000rpm离心1分钟，小心倒掉酒精，在卫生纸上吸干残液。

静置15分钟使其自然风干。

5. 以100μlTE缓冲溶液将DNA回溶。

可置于室温过夜或于65oC加热一小时，来帮助DNA回溶。

最后，取微量DNA溶液经适当稀释后，以分光光度计测波长260nm与280nm之吸光值，以计算所抽出DNA之浓度与纯度，剩余之DNA则置于4oC冰箱中保存。

结果及讨论

1. 计算出你所抽得之DNA浓度及总量，并评估所抽得之总量是否适当。

若所得量太少，讨论可能之原因。

2. 计算出A260/A280的比值，并判断所抽得之DNA的纯度。

若纯度过低，讨论可能之原因。

3. 如何知道你所抽得之DNA是属于高分子量（high-molecular-weight），而非断成较小的片段？

4. 试查寻有关从你所选定之材料中抽取genomicDNA的文献，比较你的方法和文献中的方法的差异，是否有重要的步骤为你的方法所忽略？

5.其它你认为值得讨论之发现。

实验二：

TotalRNA的制备

实验目的

一个哺乳类细胞大约含10-5μg的RNA，其中80-85%为rRNA，其余的15-20%主要是tRNA，而mRNA约占全部RNA的1-5%。

纯化totalRNA是一系列RNA分析，如北方点墨法（Northernblotting），反转录聚合μ连锁反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR），poly（A）+RNA的分离，cDNA合成，活体外转译（invitrotranslation）等的前置步骤。

本实验将从你所选定之动物组织或细胞中抽取totalRNA，作为后续实验如反转录聚合脢连锁反应及北方点墨法之材料。

你将从本实验学习如何自细胞或组织中萃取并纯化RNA。

实验原理

本RNA抽取原理，是以Chomczynski和Sacchi（Anal.Biochem.162:

156-159,1987）所发展之单一步骤抽取RNA方法修改而成。

其以高浓度之guanidinesalts及urea等变性剂，使细胞溶解，并立即破坏胞器所释放之RNase的活性。

所得之细胞溶解液再以酸性之phenol/chloroform萃取，会分成两层，DNA及蛋白质会在有机层或接口层，而只有RNA在水层，如此可有效分离出RNA。

将萃取得之totalRNA以isopropanol沉淀，并溶于RNase-free的水中即可。

最后，测波长260nm与280nm之吸光值，以计算所抽出RNA之浓度与纯度。

纯RNA的A260/A280比值约为1.8-2.0。

RNA浓度计算方式为OD260=1时，RNA浓度约为40μg/ml。

107个哺乳类细胞约可获得100-200μg的RNA，而100mg的组织约可获得150-500μg的RNA，依不同组织而定。

 RNA的制备常因RNase的污染而失败。

RNase是很稳定的酵素，不易破坏其活性，故要避免RNase的污染，需采取一些措施。

例如RNA制备所用之水及溶液应该以diethylpyrocarbonate（DEPC）处理。

DEPC会与RNase形成共价键结，而破坏其活性。

所使用之玻璃器皿要以高温烘烤处理过，并使用未拆封之可弃式塑料器材。

手亦是RNase污染的主要来源，故操作时要戴上手套。

实验材料

∙UltraspecTMRNA分离试剂：

来自BiotecxLaboratories,Inc.,内含guanidiniumthiocyanate,urea,Sarcosyl,phenol等，浓度不明，溶液为酸性（约pH4）。

∙Chloroform

∙Isopropanol

∙70%ethanol

∙DEPC处理过的水：

每100ml水加入0.1mlDEPC，在室温下处理至少12小时，再以高压灭菌除去未反应之DEPC（DEPC可能会致癌，操作时须戴手套及在通风橱内）。

实验步骤

1.取10-100mg动植物组织或5-10x106个培养细胞，溶于1mlUltraspecTMRNA分离试剂中，以干热灭菌过之组织研磨器研磨。

然后，静置于冰上5分钟。

（此步骤会使细胞溶解，并使细胞内RNA和蛋白质之结合物解离。

）

2.加入0.2mlchloroform，并剧烈摇荡15秒，重新静置于冰上5分钟。

然后于4oC12,000g离心15分钟。

离心后，萃取液会分成上面的水层及下面的有机层。

（在酸性萃取条件下，RNA会在水层，而DNA及蛋白质会在有机层或界面层。

）

3.小心吸取上层（约取其4/5体积）至另一微量离心管，加入等体积的isopropanol，混和均匀后，置于4oC30分钟。

（此步骤会使RNA沉淀。

）

4.于4oC12,000g离心30分钟，小心倒掉上清液，留下底部少量RNA白色沈淀。

5.以1ml70%酒精清洗，于4oC12,000g离心3分钟，倒掉上清液，真空抽干残留的酒精5-10分钟即可，勿使RNA完全干燥，否则不易回溶。

6.以100μlDEPC处理过的水，将RNA白色沈淀完全回溶。

若RNA不易回溶时，可将其加热至55-60oC15分钟。

7.最后，取少量RNA溶液经适当稀释后，以分光光度计测波长260nm与280nm之吸光值，以计算所抽出RNA之浓度与纯度，剩余之RNA则置于-70oC冰箱中保存。

结果及讨论

1. 计算出你所抽得之RNA浓度及总量，并评估所抽得之总量是否适当。

若所得量太少，讨论可能之原因。

2. 计算出A260/A280的比值，并判断所抽得之RNA的纯度。

若纯度过低，讨论可能之原因。

3. 如何判断你所抽得之RNA大多是完整的，而非断成较小的片段？

4. 试查寻有关从你所选定之材料中抽取totalRNA的文献，比较你的方法和文献中的方法的差异，是否有重要的步骤为你的方法所忽略？

5. 其它你认为值得讨论之发现。

实验三：

聚合脢连锁反应

实验目的

聚合脢连锁反应（polymerasechainreaction,简称PCR）技术的发明，是分子遗传学上的一大革命。

它可以非常省时地从少量的DNA复制出特定的DNA片段。

目前已广泛地应用在许多领域上。

本实验将把你在实验二所抽取到的totalRNA，先以反转录脢（reversetranscriptase）作成cDNA，再以PCR去放大（amplification）特定的DNA片段。

此方法又称为反转录聚合脢连锁反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,简称RT-PCR）。

你将从本实验中熟悉PCR实验操作技巧。

实验原理

 传统遗传学筛选特定DNA的方法，是将大量DNA嵌入质体，再将此质体植入细菌中，最后经由菌株选殖（cloning）而得。

如此极为耗时耗事。

PCR技术于1980年间首先由KaryMullis设计出来。

其实验原理是先将DNA变性（denature）成单股DNA，再以欲复制基因片段两个端点设计出的引子（primer）与单股DNA黏合（annealing），经由DNA聚合脢合成另一股互补DNA。

而此双股DNA可再经由加热变性成两条单股DNA，再与引子黏合，再经聚合作用合成两条双股DNA。

如此，经由多次循环的变性、黏合及聚合作用，特定DNA可以2n的几何倍数复制，而达到特定基因放大的效果。

目前，PCR反应都使用可耐高温之DNA聚合脢，并在可设定及自动升降温度之热循环反应器（thermalcycler）内进行。

反转录聚合脢连锁反应（RT-PCR）可用来分析少量特定的mRNA。

其是以mRNA为模版，以oligo（dT）或randomhexamer为引子，用反转录脢复制出与mRNA互补的第一股cDNA（first-strandcDNA），再以此cDNA为模版，经由PCR放大作用后，则可做特定mRNA的进一步分析。

实验材料

∙DEPC处理过的水

∙下列试剂来自Clontech公司所售之1st-StrandTMcDNASynthesisKit：

∙5Xreactionbuffer：

250mMTris-HCl（pH8.3），375mMKCl，15mMMgCl2

∙Randomhexamer：

20μM

∙四种dNTP混合液：

每种10mM

∙RecombinantRNaseinhibitor：

40units/μl

∙M-MLVreversetranscriptase：

200units/μl

∙10XTaqreactionbuffer：

500mMKCl，100mMTris-HCl（pH9.0），1%TritonX-100，15mMMgCl2

∙TaqDNApolymerase：

5units/μl

实验步骤

（一） 第一股cDNA的合成

1.在一个0.5ml的微量离心管内加入1μg的totalRNA，再以DEPC处理过的水补到总体积为12.5μl。

2.加入1μl的randomhexamer，将此微量离心管加热至70℃2分钟，然后快速置于冰上。

3.加入以下物质完成混合：

 5Xreactionbuffer      4μl

 四种dNTP混合液（每种10mM）  1μl

 RNaseinhibitor       0.5μl

 M-MLVreversetranscriptase（200U/μl） 1μl

4.将此微量离心管培养于42℃1小时。

5. 加热至94℃5分钟，以停止cDNA的合成并破坏DNase的活性。

快速离心后加入DEPC水80μl，保存于-70℃。

（二）PCR放大反应

1. 在一个0.5ml的薄壁微量离心管内加入以下物质：

 蒸馏水       58μl

 10Xreactionbuffer    10μl

 四种dNTP混合液（每种10mM）2μl

 引子1（10μM）     4μl

 引子2（10μM）     4μl

 第一股cDNA     20μl

 TaqDNApolymerase（5U/μl） 2μl

若使用之热循环反应器无顶盖加热装置，则加入约100μl的矿物油盖在反应液上，以防止加热过程中水份蒸发。

2. 将微量离心管放入热循环反应器内。

反应的条件如下：

先于95℃变性2分钟，再进行35个循环的95℃1分钟、55℃2分钟、72℃3分钟，最后于72℃7分钟使聚合反应完全。

其中黏合温度应视引子的Tm调整。

3.放大后的DNA产物以琼胶电泳分析。

结果及讨论

1. 请说明本实验之引子序列选定的理由。

2. 请说明本实验之PCR反应条件选定的理由。

3. 你是否得到单一条PCR产物？

是否和预期之大小一样？

请说明你的结果。

4.其它你认为值得讨论之发现。

实验四：

DNA选殖（DNAcloning）

实验目的

带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一个很重要的工具，将特定基因接入载体（vector）完成质体建构后，可以对特定基因做进一步研究。

本实验将把你在实验三所得之PCR产物接入载体内，建构一带有特定cDNA的质体。

你将从本实验中学习如何将DNA接入载体中。

实验原理

首先要纯化PCR产物。

将PCR反应进行琼胶电泳，把所要的DNA片段切下，放入透析袋中，再将透析袋放入电泳槽内进行电泳，DNA会跑出琼胶，但不能跑出透析袋，最后将透析袋内溶液吸出，沉淀浓缩即可。

另外，在进行质体建构之前，需先将载体以限制脢切开。

本实验所使用之载体为来自Promega公司之pGEM-TEasy，其构造请见附图一。

pGEM-TEasy已经限制脢EcoRV切开，又以terminaltransferase在其两个3’端各加一个thymine。

其乃专用来选殖PCR产物，因为一些耐高温之DNApolymerase常在PCR片段的3’端多加一个adenine，所以与pGEM-TEasy会很容易连接。

另外，pGEM-TEasy突出的thymine也会防止载体本身自己连接（self-ligation），使后续的筛选较容易。

经由DNA连接脢（DNAligase）的作用，可将PCR片段与载体DNA连接，再将其转型（transformation）入大肠杆菌，即可选殖出建构完成之质体。

实验材料

∙10Xloadingbuffer：

20%Ficoll400，0.25%Bromophenolblue，0.25%Xylenecyanol

∙透析膜袋（dialysismembranetubing）：

来自SpectrumMedicalIndustries,Inc.,Spectra/PorMWCO12-14,000

∙10XT4DNAligasebuffer：

300mMTris-HCl（pH7.8），100mMMgCl2，100mMDTT，10mMATP

∙pGEM-TEasy：

50ng/μl，其构造请见附图一

∙T4DNAligase：

3Weissunits/μl

实验步骤

（一）纯化DNA片段

1.将实验三之PCR反应液以酒精沉淀，回溶于10淤

2.加入1μl10Xloadingbuffer，混合后加载2%琼胶，进行电泳。

3.电泳后，将琼胶置于紫外光箱上观察，把含有所要之DNA片段的琼胶部位切下。

4.将切下的琼胶块置入透析袋内，加入适量TAEbuffer，再将开口夹住，将透析袋放入电泳槽内进行电泳。

电泳时间约15分钟，将电极逆转后再电泳约15秒。

5.将透析袋取出，打开一端的夹子，将溶液吸到一微量离心管中，再以酒精将DNA沉淀，回溶于10μlTE。

（二） DNA连接反应

1.于微量离心管中加入以下物质，并完成混合：

 蒸馏水     2μl

 10XT4DNAligasebuffer1μl

 pGEM-TEasy   1μl

 纯化之PCRDNA片段 5μl

 T4DNAligase   1μl

2. 置于4oC冰箱中16小时。

取5μl去转型大肠杆菌（实验五）。

 图一

实验五：

基因转型（genetransformation）

实验目的

带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一个很重要的工具，将质体送入细菌的过程称为基因转形，经由基因转型可使质体在细菌中大量复制，以备进一步研究。

本实验将把你在前面转殖实验中cDNA和质体DNA的连结反应送入细菌。

你将从本实验学习如何进行基因转型作用。

实验原理

早在1970年左右，有人发现细菌经由冰冷的CaCl2处理后，可以转染（transfect）噬菌体凹后来发现同样的方法可以用来转型质体及大肠杆菌染色体DNA。

可见经由CaCl2处理后的大肠杆菌胜任细胞（competentcell），具有纳入DNA的能力，虽然机制仍然不清楚，但是此方法却在实验室中被广泛使用。

本实验是先将大肠杆菌以CaCl2处理成胜任细胞，再加入带有抗ampicillin基因的质体，以使其纳入大肠杆菌中。

42oC的热休克作用有助于提高基因转型作用的效率，再经由一段恢复期后，就可以生长在含ampicillin的培养基上以便筛选。

此方法的转型效率为每μg的supercoiledDNA可产生5x106至2x107个转型菌株。

实验材料

∙E.colistrainDH5α

∙LB培养液：

每公升含10gtryptone，5gyeastextract，5gNaCl

∙LB固体培养基：

配方如LB培养液，加上15gagar，高压灭菌后让其冷却至约50oC，视需要加入抗生素、IPTG、X-Gal等，立即倒入培养皿内，待其固化。

∙50mMCaCl2溶液

∙100mg/mlampicillin

实验步骤

1.将作为宿主（host）的大肠杆菌DH5α，于2mlLB培养液中做隔夜培养。

2.第二天，取0.2ml的饱和菌液加入10mlLB培养液，于37oC200rpm摇晃培养至菌液的OD600为0.4，约1小时。

3.将菌液倒入15ml离心管中，在2,500g下离心5分钟，倒掉上清液。

菌液沈淀则以5ml冰过的50mMCaCl2溶液回溶，并静置冰上30分钟。

经由CaCl2处理过的细菌变得较脆弱，故以下操作勿太激烈且在冰上进行。

4.再度在2,500g下离心5分钟，倒掉上清液。

菌液沈淀则以0.5ml冰过的50mMCaCl2溶液小心回溶，此时已完成胜任细胞的制备。

5.取适量的质体DNA与200μl的胜任细胞混合后，置于冰上30分钟。

期间每5-10分钟拍打混合物一次，以防止菌液沈淀。

6.放入42oC水浴2分钟热休克处理后，立即放回冰上。

7.加入1mlLB培养液，于37oC200rpm摇晃培养1小时进行恢复。

8.取已完成基因转型作用的菌液，以推棒均匀涂抹于含100μg/mlampicillin,0.5mMIPTG,40μg/mlX-Gal的LB固体培养基上，每个培养基含10μl至400μl的菌液，做隔夜培养。

长出的单一菌株，可用于进一步的筛选。

结果及讨论

1. 计算培养基上菌落的数目。

请说明你如何从转型效率来判断所制备之胜任细胞是否成功。

2. 你所得之菌落中，蓝色及白色的比例为何？

请解释它的意义。

3. 其它你认为值得讨论之发现。

实验六：

质体DNA的少量制备和限制脢切割分析

实验目的

带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一个很重要的工具，因而必需先将质体自细菌中抽出，以备进一步研究。

本实验将从你在前面转型实验所得到的细菌中，抽取质体DNA，再进行限制脢切割分析，以确定DNA的选殖成功。

你将从本实验中学习如何自细菌中少量制备（mini-preps）质体DNA及进行限制脢切割分析。

实验原理

本实验所采用之质体DNA少量制备的方法为碱溶解法（alkalinelysismethod）。

以含有SDS及NaOH的溶液将细菌溶解，SDS会使蛋白质变性，而NaOH则使染色体及质体DNA变性。

环形质体DNA因拓朴缠