分子生物学实验手册handbook.docx

1、分子生物学实验手册handbook 分 子 生 物 学 技 术 实验手册 高雄医学院生物学系 游仲逸、张永福 编着目 录 实验一：Genomic DNA的制备 实验二：Total RNA的制备 实验三：聚合脢连锁反应 实验四：DNA选殖 实验五：基因转型 实验六：质体DNA的少量制备和限制脢切割分析 实验七：DNA定序分析 实验八：北方点墨分析 实验九：在大肠杆菌内大量表现重组蛋白 实验一：Genomic DNA的制备 实验目的 纯化genomic DNA是一系列DNA分析，如南方点墨法(Southern blotting)，聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction,

2、 PCR)，基因组库(genomic library)之建构及筛选等的前置步骤。本实验将从你所选定之动物组织或细胞中抽取genomic DNA。 你将从本实验中学习如何自细胞或组织中萃取并纯化genomic DNA。 实验原理 本实验是以动物组织或细胞作为genomic DNA的来源。 先以阴离子性清洁剂如sodium dodecyl sulfate (SDS)将细胞打破，并使蛋白质变性，以抑制DNase的活性，也让DNA上的蛋白质解离。同时加入高浓度的ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)亦可抑制DNase的活性。另外以RNase除去RNA。 而蛋白质则

3、不以有机溶剂如phenol来萃取掉，而是以盐类沉淀方法去除。如此可避免使用具毒性之有机溶剂，而DNA亦较不会断裂。 萃取到的genomic DNA以酒精沉淀法浓缩，并回溶于TE缓冲溶液中保留。最后，测波长260 nm与280 nm之吸光值，以计算所抽出DNA之浓度与纯度。 纯DNA的A260/A280比值约为1.8，比值太低时，表示蛋白质残留太多。 DNA浓度计算方式为OD260=1时，DNA浓度约为50 g/ml。 实验材料 RBC lysis solution：ammonium chloride, EDTA, sodium bicarbonate Cell lysis solution：1

4、0 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 0.5% SDS RNase A solution：4 mg/ml RNase A Protein precipitation solution：10 M ammonium acetate Isopropanol 70% ethanol TE缓冲溶液：10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA 实验步骤 1. 首先要将细胞溶解，不同材料之处理方式略有差别。 a) 若为全血，则取300 l于微量离心管内，加入900 l RBC lysis solution，上下颠倒摇动使其混合，于室温培养10分钟，

5、培养期间再颠倒摇动一次。于12,000 rpm离心20秒，以微量吸管吸去上清液，留下白血球沉淀及约10-20 l的残留液。剧烈震荡，使沉淀细胞回溶于残留液内。 加入300 l cell lysis solution，并以微量吸管吸冲多次，使细胞溶解，若细胞无法完全溶解，则将其培养于37 oC中至完全溶解为止。 b) 若为动物组织，则取约10-20 mg于微量离心管内，加入600 l预先冰过之cell lysis solution，立即以研磨棒研磨30-50下。 于65 oC培养15-60分钟，使组织溶解。 (若要提高DNA的产量，则可改加3 l 20 mg/ml proteinase K so

6、lution，然后于55 oC培养3-12小时。) 2. 加入1.5 l(全血)或3 l(动物组织) RNase A solution，上下颠倒摇动25次后培养于37 oC中15-60分钟。 3. 将样品冷却至室温。 加入100 l(全血)或200 l(动物组织) protein precipitation solution。 剧烈震荡20秒使其完全混合。 于12,000 rpm离心3分钟，蛋白质会形成深褐色致密沉淀。 4. 将含有DNA的上清液倒入另一个微量离心管，并加入300 l(全血)或600 l(动物组织) 100% isopropanol。 上下颠倒摇动50次后，会产生白色的DNA细

7、丝。于12,000 rpm离心1分钟，可看到白色的DNA沉淀。将上清液倒掉，并在卫生纸上吸干残液。 加入300 l(全血)或600 l(动物组织)70% ethanol，上下颠倒摇动数次以清洗DNA沉淀。于12,000 rpm离心1分钟，小心倒掉酒精，在卫生纸上吸干残液。静置15分钟使其自然风干。 5. 以100 l TE缓冲溶液将DNA回溶。 可置于室温过夜或于65 oC加热一小时，来帮助DNA回溶。 最后，取微量DNA溶液经适当稀释后，以分光光度计测波长260 nm与280 nm之吸光值，以计算所抽出DNA之浓度与纯度，剩余之DNA则置于4oC 冰箱中保存。 结果及讨论 1. 计算出你所抽

8、得之DNA浓度及总量，并评估所抽得之总量是否适当。若所得量太少，讨论可能之原因。 2. 计算出A260/A280的比值，并判断所抽得之DNA的纯度。 若纯度过低，讨论可能之原因。 3. 如何知道你所抽得之DNA是属于高分子量(high-molecular-weight)，而非断成较小的片段？ 4. 试查寻有关从你所选定之材料中抽取genomic DNA的文献，比较你的方法和文献中的方法的差异，是否有重要的步骤为你的方法所忽略？ 5. 其它你认为值得讨论之发现。 实验二：Total RNA的制备 实验目的 一个哺乳类细胞大约含10-5 g的RNA，其中80-85% 为rRNA，其余的15-20%

9、 主要是tRNA，而mRNA约占全部RNA的1-5%。 纯化total RNA是一系列RNA分析，如北方点墨法(Northern blotting)，反转录聚合连锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)，poly(A)+ RNA的分离，cDNA合成，活体外转译(in vitro translation)等的前置步骤。 本实验将从你所选定之动物组织或细胞中抽取total RNA，作为后续实验如反转录聚合脢连锁反应及北方点墨法之材料。 你将从本实验学习如何自细胞或组织中萃取并纯化RNA。 实验原理 本RNA抽取原理，是

10、以Chomczynski和Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987)所发展之单一步骤抽取RNA方法修改而成。 其以高浓度之guanidine salts及urea等变性剂，使细胞溶解，并立即破坏胞器所释放之RNase的活性。所得之细胞溶解液再以酸性之phenol/chloroform萃取，会分成两层，DNA及蛋白质会在有机层或接口层，而只有RNA在水层，如此可有效分离出RNA。将萃取得之total RNA以isopropanol沉淀，并溶于RNase-free的水中即可。 最后，测波长260 nm与280 nm之吸光值，以计算所抽出RNA之浓度与纯度。

11、 纯RNA的A260/A280比值约为1.8-2.0。 RNA浓度计算方式为OD260=1时，RNA浓度约为40 g/ml。107个哺乳类细胞约可获得100-200 g的RNA，而100 mg的组织约可获得150-500 g的RNA，依不同组织而定。 RNA的制备常因RNase的污染而失败。 RNase是很稳定的酵素，不易破坏其活性，故要避免RNase的污染，需采取一些措施。例如RNA制备所用之水及溶液应该以diethylpyrocarbonate(DEPC)处理。DEPC会与RNase形成共价键结，而破坏其活性。所使用之玻璃器皿要以高温烘烤处理过，并使用未拆封之可弃式塑料器材。 手亦是RNa

12、se污染的主要来源，故操作时要戴上手套。 实验材料 UltraspecTM RNA分离试剂：来自Biotecx Laboratories, Inc., 内含guanidinium thiocyanate, urea, Sarcosyl, phenol等，浓度不明，溶液为酸性(约pH 4)。 Chloroform Isopropanol 70% ethanol DEPC处理过的水：每100 ml水加入0.1 ml DEPC，在室温下处理至少12小时，再以高压灭菌除去未反应之DEPC (DEPC可能会致癌，操作时须戴手套及在通风橱内)。 实验步骤 1. 取10-100 mg动植物组织或5-10x1

13、06个培养细胞，溶于1 ml UltraspecTM RNA分离试剂中，以干热灭菌过之组织研磨器研磨。然后，静置于冰上5分钟。 (此步骤会使细胞溶解，并使细胞内RNA和蛋白质之结合物解离。) 2. 加入0.2 ml chloroform，并剧烈摇荡15秒，重新静置于冰上5分钟。 然后于4oC 12,000 g离心15分钟。 离心后，萃取液会分成上面的水层及下面的有机层。 (在酸性萃取条件下，RNA会在水层，而DNA及蛋白质会在有机层或界面层。) 3. 小心吸取上层(约取其4/5体积)至另一微量离心管，加入等体积的isopropanol，混和均匀后，置于4oC 30分钟。 (此步骤会使RNA沉淀

14、。) 4. 于4oC 12,000 g离心30分钟，小心倒掉上清液，留下底部少量RNA白色沈淀。 5. 以1 ml 70% 酒精清洗，于4oC 12,000 g离心3分钟，倒掉上清液，真空抽干残留的酒精5-10分钟即可，勿使RNA完全干燥，否则不易回溶。 6. 以100 l DEPC处理过的水，将RNA白色沈淀完全回溶。若RNA不易回溶时，可将其加热至55-60 oC 15分钟。 7. 最后，取少量RNA溶液经适当稀释后，以分光光度计测波长260 nm与280 nm之吸光值，以计算所抽出RNA之浓度与纯度，剩余之RNA则置于-70 oC冰箱中保存。 结果及讨论 1. 计算出你所抽得之RNA浓度

15、及总量，并评估所抽得之总量是否适当。若所得量太少，讨论可能之原因。 2. 计算出A260/A280的比值，并判断所抽得之RNA的纯度。 若纯度过低，讨论可能之原因。 3. 如何判断你所抽得之RNA大多是完整的，而非断成较小的片段？ 4. 试查寻有关从你所选定之材料中抽取total RNA的文献，比较你的方法和文献中的方法的差异，是否有重要的步骤为你的方法所忽略？ 5. 其它你认为值得讨论之发现。 实验三：聚合脢连锁反应 实验目的 聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, 简称PCR)技术的发明，是分子遗传学上的一大革命。它可以非常省时地从少量的DNA复制出特定的DN

16、A片段。 目前已广泛地应用在许多领域上。本实验将把你在实验二所抽取到的total RNA，先以反转录脢(reverse transcriptase)作成cDNA，再以PCR去放大(amplification)特定的DNA片段。此方法又称为反转录聚合脢连锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, 简称RT-PCR)。 你将从本实验中熟悉PCR实验操作技巧。 实验原理 传统遗传学筛选特定DNA的方法，是将大量DNA嵌入质体，再将此质体植入细菌中，最后经由菌株选殖(cloning)而得。如此极为耗时耗事。 PCR技术于1980年间首先由K

17、ary Mullis设计出来。 其实验原理是先将DNA变性(denature)成单股DNA，再以欲复制基因片段两个端点设计出的引子(primer)与单股DNA黏合(annealing)，经由DNA聚合脢合成另一股互补DNA。而此双股DNA可再经由加热变性成两条单股DNA，再与引子黏合，再经聚合作用合成两条双股DNA。如此，经由多次循环的变性、黏合及聚合作用，特定DNA可以2n的几何倍数复制，而达到特定基因放大的效果。目前，PCR反应都使用可耐高温之DNA聚合脢，并在可设定及自动升降温度之热循环反应器(thermal cycler)内进行。 反转录聚合脢连锁反应(RT-PCR)可用来分析少量特定

18、的mRNA。 其是以mRNA为模版，以oligo(dT)或random hexamer为引子，用反转录脢复制出与mRNA互补的第一股cDNA(first-strand cDNA)，再以此cDNA为模版，经由PCR放大作用后，则可做特定mRNA的进一步分析。 实验材料 DEPC处理过的水 下列试剂来自Clontech公司所售之1st-StrandTM cDNA Synthesis Kit： 5X reaction buffer：250 mM Tris-HCl (pH 8.3)，375 mM KCl，15 mM MgCl2 Random hexamer：20 M 四种dNTP混合液：每种10 mM

19、 Recombinant RNase inhibitor：40 units/l M-MLV reverse transcriptase：200 units/l 10X Taq reaction buffer：500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 9.0)，1% Triton X-100，15 mM MgCl2 Taq DNA polymerase：5 units/l 实验步骤 (一) 第一股cDNA的合成 1. 在一个0.5 ml的微量离心管内加入1 g的total RNA，再以DEPC处理过的水补到总体积为12.5 l。 2. 加入1 l的random hexamer

20、，将此微量离心管加热至70 2分钟，然后快速置于冰上。 3. 加入以下物质完成混合： 5X reaction buffer 4 l 四种dNTP混合液(每种10 mM) 1 l RNase inhibitor 0.5 l M-MLV reverse transcriptase (200U/l) 1 l 4. 将此微量离心管培养于42 1小时。 5. 加热至94 5分钟，以停止cDNA的合成并破坏DNase的活性。 快速离心后加入DEPC水80 l，保存于-70。 (二) PCR放大反应 1. 在一个0.5 ml的薄壁微量离心管内加入以下物质： 蒸馏水 58 l 10X reaction buf

21、fer 10 l 四种dNTP混合液(每种10 mM) 2 l 引子1 (10 M) 4 l 引子2 (10 M) 4 l 第一股cDNA 20 l Taq DNA polymerase (5U/l) 2 l 若使用之热循环反应器无顶盖加热装置，则加入约100 l的矿物油盖在反应液上，以防止加热过程中水份蒸发。 2. 将微量离心管放入热循环反应器内。 反应的条件如下：先于95变性2分钟，再进行35个循环的95 1分钟、55 2分钟、72 3分钟，最后于72 7分钟使聚合反应完全。 其中黏合温度应视引子的Tm调整。 3. 放大后的DNA产物以琼胶电泳分析。 结果及讨论 1. 请说明本实验之引子序

22、列选定的理由。 2. 请说明本实验之PCR反应条件选定的理由。 3. 你是否得到单一条PCR产物？ 是否和预期之大小一样？ 请说明你的结果。 4. 其它你认为值得讨论之发现。 实验四：DNA选殖(DNA cloning) 实验目的 带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一个很重要的工具，将特定基因接入载体(vector)完成质体建构后，可以对特定基因做进一步研究。本实验将把你在实验三所得之PCR产物接入载体内，建构一带有特定cDNA的质体。你将从本实验中学习如何将DNA接入载体中。 实验原理 首先要纯化PCR产物。 将PCR反应进行琼胶电泳，把所要的DNA片段切下，放入透析袋中，再将透析袋放入

23、电泳槽内进行电泳，DNA会跑出琼胶，但不能跑出透析袋，最后将透析袋内溶液吸出，沉淀浓缩即可。另外，在进行质体建构之前，需先将载体以限制脢切开。本实验所使用之载体为来自Promega公司之pGEM-T Easy，其构造请见附图一。 pGEM-T Easy已经限制脢EcoRV切开，又以terminal transferase在其两个3端各加一个thymine。其乃专用来选殖PCR产物，因为一些耐高温之DNA polymerase常在PCR片段的3端多加一个adenine，所以与pGEM-T Easy会很容易连接。 另外，pGEM-T Easy突出的thymine也会防止载体本身自己连接(self-

24、ligation)，使后续的筛选较容易。经由DNA连接脢(DNA ligase)的作用，可将PCR片段与载体DNA连接，再将其转型(transformation)入大肠杆菌，即可选殖出建构完成之质体。 实验材料 10X loading buffer：20% Ficoll 400，0.25% Bromophenol blue，0.25% Xylene cyanol 透析膜袋(dialysis membrane tubing)：来自Spectrum Medical Industries, Inc., Spectra/Por MWCO 12-14,000 10X T4 DNA ligase buff

25、er：300 mM Tris-HCl (pH 7.8)，100 mM MgCl2，100 mM DTT，10 mM ATP pGEM-T Easy：50 ng/l，其构造请见附图一 T4 DNA ligase：3 Weiss units/l 实验步骤 (一)纯化DNA片段 1. 将实验三之PCR反应液以酒精沉淀，回溶于10 淤 2. 加入1 l 10X loading buffer，混合后加载2%琼胶，进行电泳。 3. 电泳后，将琼胶置于紫外光箱上观察，把含有所要之DNA片段的琼胶部位切下。 4. 将切下的琼胶块置入透析袋内，加入适量TAE buffer，再将开口夹住，将透析袋放入电泳槽内进行

26、电泳。电泳时间约15分钟，将电极逆转后再电泳约15秒。 5. 将透析袋取出，打开一端的夹子，将溶液吸到一微量离心管中，再以酒精将DNA沉淀，回溶于10 l TE。 (二) DNA连接反应 1. 于微量离心管中加入以下物质，并完成混合： 蒸馏水 2 l 10X T4 DNA ligase buffer 1 l pGEM-T Easy 1 l 纯化之PCR DNA片段 5 l T4 DNA ligase 1 l 2. 置于4 oC冰箱中16小时。 取5 l去转型大肠杆菌(实验五)。 图一 实验五：基因转型(gene transformation) 实验目的 带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一

27、个很重要的工具，将质体送入细菌的过程称为基因转形，经由基因转型可使质体在细菌中大量复制，以备进一步研究。本实验将把你在前面转殖实验中cDNA和质体DNA的连结反应送入细菌。 你将从本实验学习如何进行基因转型作用。 实验原理 早在1970年左右，有人发现细菌经由冰冷的CaCl2处理后，可以转染(transfect)噬菌体凹后来发现同样的方法可以用来转型质体及大肠杆菌染色体DNA。可见经由CaCl2处理后的大肠杆菌胜任细胞(competent cell)，具有纳入DNA的能力，虽然机制仍然不清楚，但是此方法却在实验室中被广泛使用。本实验是先将大肠杆菌以CaCl2处理成胜任细胞，再加入带有抗ampi

28、cillin基因的质体，以使其纳入大肠杆菌中。 42 oC 的热休克作用有助于提高基因转型作用的效率，再经由一段恢复期后，就可以生长在含ampicillin的培养基上以便筛选。此方法的转型效率为每g的supercoiled DNA可产生5x106至2x107个转型菌株。 实验材料 E. coli strain DH5 LB培养液：每公升含10 g tryptone，5 g yeast extract，5 g NaCl LB固体培养基：配方如LB培养液，加上15 g agar，高压灭菌后让其冷却至约50 oC，视需要加入抗生素、IPTG、X-Gal等，立即倒入培养皿内，待其固化。 50 mM C

29、aCl2溶液 100 mg/ml ampicillin 实验步骤 1. 将作为宿主(host)的大肠杆菌DH5，于2 ml LB培养液中做隔夜培养。 2. 第二天，取0.2 ml的饱和菌液加入10 ml LB培养液，于37 oC 200 rpm摇晃培养至菌液的OD600为0.4，约1小时。 3. 将菌液倒入15 ml离心管中，在2,500 g下离心5分钟，倒掉上清液。 菌液沈淀则以5 ml冰过的50 mM CaCl2溶液回溶，并静置冰上30分钟。 经由CaCl2处理过的细菌变得较脆弱，故以下操作勿太激烈且在冰上进行。 4. 再度在2,500 g下离心5分钟，倒掉上清液。 菌液沈淀则以0.5 m

30、l冰过的50 mM CaCl2溶液小心回溶，此时已完成胜任细胞的制备。 5. 取适量的质体DNA与200 l的胜任细胞混合后，置于冰上30分钟。期间每5-10分钟拍打混合物一次，以防止菌液沈淀。 6. 放入42 oC水浴2分钟热休克处理后，立即放回冰上。 7. 加入1 ml LB培养液，于37 oC 200 rpm摇晃培养1小时进行恢复。 8. 取已完成基因转型作用的菌液，以推棒均匀涂抹于含100 g/ml ampicillin, 0.5 mM IPTG, 40 g/ml X-Gal的LB固体培养基上，每个培养基含10 l至400 l 的菌液，做隔夜培养。长出的单一菌株，可用于进一步的筛选。

31、结果及讨论 1. 计算培养基上菌落的数目。 请说明你如何从转型效率来判断所制备之胜任细胞是否成功。 2. 你所得之菌落中，蓝色及白色的比例为何？ 请解释它的意义。 3. 其它你认为值得讨论之发现。 实验六：质体DNA的少量制备和限制脢切割分析 实验目的 带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一个很重要的工具，因而必需先将质体自细菌中抽出，以备进一步研究。本实验将从你在前面转型实验所得到的细菌中，抽取质体DNA，再进行限制脢切割分析，以确定DNA的选殖成功。你将从本实验中学习如何自细菌中少量制备(mini-preps)质体DNA及进行限制脢切割分析。 实验原理 本实验所采用之质体DNA少量制备的方法为碱溶解法(alkaline lysis method)。以含有SDS及NaOH的溶液将细菌溶解，SDS会使蛋白质变性，而NaOH则使染色体及质体DNA变性。环形质体DNA因拓朴缠