食品中过敏原成份环介导等温扩增LAMP检测方式第21部份胡萝卜编制说明.docx
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食品中过敏原成份环介导等温扩增LAMP检测方式第21部份胡萝卜编制说明
食品中过敏原成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第21部分:
胡萝卜
编制说明
1基本信息
标准草案名称
中文
食品中过敏原成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法
第21部分:
胡萝卜
英文
Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethod
forallergencomponentsinfoodPart21:
Carrot
与国际标准和国外先进标准一致程度情况
等同
修改
非等效
标准号
/
英文名称
/
中文名称
/
任务来源
批准立项的文件名称和文件号
《关于下达2012年第一批出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知(国认科[2012]36号)》
计划编号
2012B141
制(修)订情况
制订
修订
替代的标准编号
/
起止时间
2012年01月~2013年09月
起草单位
中国检验检疫科学研究院、山东出入境检验检疫局
起草人
孙敏、高宏伟、龚方、刘彩霞
专业类别
1、食品(化妆品)检验;2、卫生检疫;3、动物检疫;4、植物检疫;
5、纺织产品检验;6、轻工产品检验;7、机电产品检验;8、化工、矿产品和金属材料检验;9、管理;10、鉴定;11包装及危险化学品
标准体系表代码
调整情况
2背景情况
目的、意义
食物过敏是指致敏机体再次接受食物中相同的过敏原刺激后,由IgE介导的体液免疫反应。
这种过敏反应可引发呼吸系统、肠胃系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉和骨骼等不同形式的临床症状,严重的可导致休克甚至死亡。
食物过敏至今尚无有效疗法,各过敏原引发过敏反应的最低量尚无定论。
在许多情况下,极微量的过敏原即可造成严重后果。
目前,预防食物过敏的唯一途径是严防有过敏体质的人接触过敏原。
在食品工业日益发达,食品的加工过程和成分日益复杂的今天,食品过敏发病率日益增高,给人们的生命健康造成了巨大威胁,食品过敏已成为WHO和世界粮农组织关注的重大卫生学问题。
胡萝卜是一种质脆味美、营养丰富的家常蔬菜,素有“小人参”之称。
胡萝卜富含糖类、脂肪、挥发油、胡萝卜素、维生素A、维生素B1、维生素B2、、钙、铁等多种营养成分,同时也是一种常见的食物过敏原。
有文献报道,胡萝卜、苹果、大豆、榛子、猕猴桃、小麦是柏林人最常见的食物过敏原。
瑞士专家报道,大约25%的食物过敏者会对胡萝卜产生过敏反应。
《亚运食品安全食品过敏原标识标注》地方技术规范目前已经实施,规范列出可以导致过敏反应的食品名单,要求含有名单上过敏原的亚运食品必须如实标注,胡萝卜位列其中。
本标准选择胡萝卜基因作为检测靶标设计引物,建立检测过敏原胡萝卜成分的LAMP检测方法。
该标准的建立对于确保食物标签真实准确,改进食品安全,保护消费者利益具有重要意义。
与国内外相关标准、文献的关系
胡萝卜过敏原实时荧光PCR检测方法的行业标准已报批、待发布。
本标准采用LAMP技术,对仪器要求不高,不需要荧光PCR仪,即可对食品中胡萝卜过敏原进行定性检测。
3编制过程
准备阶段(可选项)
分工情况
山东出入境检验检疫局承担引物设计和方法建立工作,中国检验检疫科学研究院承担方法验证工作。
标准草案编写情况
完成标准草案的编写。
征求意见情况(适用于送审稿)
完成标准的征求意见。
审定情况
(适用于报批稿)
完成标准的审定。
预期的管理目标(适用于规程类标准)或技术指标(适用于方法类标准)
该方法的检测低限为%(W/W)。
4主要技术内容的确定
1、国内外相关的标准要求。
2、测定步骤:
3、方法灵敏度要求
4、提供的图谱:
1材料
供试材料
不同品系的故萝卜肉质根样本由寿光市胡萝卜基地惠赠。
故萝卜种子样本来自山东出入境检验检疫局,为外贸公司自美国、日本、法国、韩国、澳大利亚进口后,送检验检疫局供检验检疫的样品。
从当地超市购买含有、可能含有以及不含胡萝卜成分的食品共10种,作为本实验的供试材料,用于分析方法的可行性和灵敏性。
从当地超市购买核桃,山核桃,花生,腰果,杏仁,开心果,葵花子,芝麻,栗子,大豆,大麦,小麦,燕麦,黑麦,大米,牛肉,羊肉,猪肉,鸡肉,虾,以及常见的蔬菜,如大白菜,青椒,洋葱,芹菜,黄瓜,其他伞形科植物:
八角、茴香、小茴香、孜然,用于分析引物的特异性。
主要试剂
除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。
实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。
所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
检测用引物序列
胡萝卜成分LAMP扩增引物详见表1。
表1检测用引物
B
名称
编号
序列
LAMP引物序列
外侧上游引物(F3)
5’-GAAATTGGCCTCCCGTGC-3’
外侧下游引物(B3)
5’-GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’
内侧上游引物(FIP)
5’-AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC-3’
内侧下游引物(BIP)
5’-GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA-3’
上游环引物(LF)
5’-CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA-3’
下游环引物(LB)
5’-GGCCCTTGGGCACAGCAAA-3’
BstDNA聚合酶。
1.2.3dNTP:
各25mmol/L。
CTAB提取缓冲液:
CTAB20g/L,氯化钠mol/L,Trismol/L,Na2EDTA20mmol/L,pH,高压灭菌。
使用前加入终浓度为2%的ß-巯基乙醇。
CTAB沉淀液:
CTAB5g/L,氯化钠mol/L,pH,高压灭菌。
1×ThermoPol反应缓冲液:
20mMTris-HCl,10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,%TritonX-100。
TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl(),1mmol/LEDTA()。
仪器和设备
水浴锅或加热模板:
65℃±1℃和80℃±1℃。
离心机:
最大离心力≥16000g。
微量移液器:
10μL、100μL、200μL、1000μL。
冰箱:
2℃-8℃,-20℃。
高压灭菌器。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
pH计。
天平:
感量。
2方法
样品处理
称取待测样品10g,用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀。
胡萝卜基因组DNA的提取
CTAB法
称取经过预处理的待测样本1g,转入15mL离心管中,半固体样品和液体样品取2mL~4mL。
加入5mL65℃预热的CTAB提取缓冲液和RNA酶(使其终浓度为10μg/mL),颠倒混匀后65℃温育30min,期间颠倒混匀离心管2次~3次;12000g离心10min,取1mL上清液至2mL离心管中;加入与上清液等体积的三氯甲烷,颠倒混匀后,12000g离心10min,转移上清至新的2mL离心管中;加入2×体积CTAB沉淀液,颠倒混匀,室温静置1h;12000g离心10min,弃去上清,加入400μL氯化钠溶液溶解沉淀,加等体积三氯甲烷,颠倒混匀;12000g离心10min,取上层水相到mLEppendorf离心管中,加入倍体积4℃预冷的异丙醇溶液,颠倒混匀,4℃静置30min;12000g离心10min,弃去上清液,加入4℃预冷的70%乙醇500μL,涡旋清洗沉淀;12000g离心5min,弃去上清液,室温条件下过夜或者60℃烘15-25分钟,注意不要让沉淀过干。
加100µLTE缓冲液溶解沉淀,−20℃保存。
其他方法
待测样品DNA的提取也可用其他等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。
DNA浓度的测定
取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。
DNA的浓度按照公式1计算。
当浓度为10μg/mL-100μg/mL,A260/A280比值在之间时,适宜于实时荧光PCR扩增。
C=A260×N×50 …………………………
(1)
式中:
C ——DNA浓度(μg/mL)
A260——260nm处的吸光值
N ——核酸稀释倍数
LAMP定性检测
LAMP反应体系
反应体系总体积为25μL,其中含:
样品DNA(10ng/μL-100ng/μL)2μL,1×ThermoPol反应缓冲液μL,上游内引物((Fip,10μmol/L)μL,下游内引物(Bip,10μmol/L)μL,上游外引物(F3,10μmol/L)μL,下游外引物(B3,10μmol/L)μL,上游环引物(LF,10μmol/L)μL,下游环引物(LB,10μmol/L)μL,BstDNA聚合酶(8U/μL)1μl,dNTP(各25mmol/L)μL,甜菜碱(5mol/L)4μL,硫酸镁(100mmol/L)μL,水μL。
2.3.2LAMP反应参数
63℃恒温扩增60min,80℃5min使酶灭活,反应结束。
三、方法灵敏度要求
目前国内外针对食品过敏原成分检测方法灵敏度没有统一要求。
分子生物学方法灵敏度一般超过实际产品检测需求。
本方法绝对检测灵敏度为2pgDNA,相对灵敏度为%(W/W)。
四、实验结果
1、LAMP
(1)特异性
选择常见的食品原料,包括粮食(大豆,大麦,小麦,燕麦,黑麦,大米)、动物组织(牛、羊、猪鸡、虾)、坚果(胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁、开心果,葵花子,)、蔬菜(大白菜,青椒,洋葱,黄瓜)、其他伞形科植物(孜然、香芹、香菜、小茴香、茴香等)提取DNA,按照中的方法,进行LAMP反应。
.检测上述物种的结果均为阴性,与预期相符,表明该组引物和探针有良好的特异性,与上述物种没有交叉反应。
(2)灵敏度
随机取一种胡萝卜的DNA溶液(浓度为10ng/μL)用大豆DNA溶液(浓度为10ng/μL)进行10×梯度系列稀释后,进行LAMP检测。
结果表明:
当DNA稀释至10-5,浓度为1pg/μL,反应液中DNA低至2pg时,仍能检出。
据此,可推算出,该方法的检测低限为%
图1 不同稀释度胡萝卜DNA溶液的LAMP检测凝胶电泳图谱
从左到右胡萝卜DNA浓度依次为:
10ng、1ng、100pg、10pg、1pg
2、实际样品检测结果
(1)新鲜胡萝卜
收集了不同品系的11个胡萝卜肉质根样本(红春秀、红映2号、明福春红、世农春90、世农春王早生、红贵208、世农415、孟德尔808、长生7585、早春红冠、红星改良五寸),取其可食用肉质根,提取DNA,LAMP扩增后,进行凝胶电泳。
实验结果显示,11个样本均产生典型的梯状条带。
见图3。
图2新鲜胡萝卜的LAMP检测电泳图谱
(2)胡萝卜种子样品
收集自美国、日本、法国、韩国、澳大利亚进口的胡萝卜种子,提取DNA,进行检测。
种子样本全部产生典型的阳性扩增。
部分结果见图3。
从左到右依次为美国、日本、法国、韩国、澳大利亚进口种子样本。
图3胡萝卜种子的LAMP检测电泳图谱
1、美国;2、日本;3、法国;4、韩国;5、澳大利亚;6、阴性对照;7、阳性对照
(2)胡萝卜制品
自超市购买8种食品(5种食品的标签标示为:
含有胡萝卜成分;3种食品无相关标示),提取核酸,使用胡萝卜特异的引物,进行LAMP反应。
实验结果显示,其中的5种食品含有胡萝卜成分,见表2,图4。
表2不同食品的实时荧光PCR扩增结果
样品
胡萝卜成分标示
LAMP结果
四海春牌饺子
含有
检出
包子(超市自制)
含有
检出
康师傅方便面调料包
含有
检出
方广儿童胡萝卜面
含有
检出
君盛胡萝卜面
含有
检出
亨氏猪肝蔬菜营养米粉
N
未检出
亨氏番茄米粉
N
未检出
百乐麦乖乖面
N
未检出
N:
无相关标识
图4胡萝卜制品的LAMP检测电泳图谱
1、亨氏猪肝蔬菜营养米粉;2、康师傅方便面调料包;3、包子;4、四海春牌饺子;5、君盛胡萝卜面;6、方广儿童胡萝卜面;7、亨氏番茄米粉;8、百乐麦乖乖面
5验证情况(适用于方法类标准)
验证单位情况
必填
验证单位
验证人员
验证时间
XXXX年XX月XX日
XXXX年XX月XX日
XXXX年XX月XX日
XXXX年XX月XX日
XXXX年XX月XX日
XXXX年XX月XX日
XXXX年XX月XX日
验证过程
采用山东出入境检验检疫局提供的引物、实验材料及实验方法,对该方法进行验证:
1.稳定性实验
取阳性胡萝卜1~5号的DNA作为模板,进行LAMP等温扩增反应,共进行3次实验,并对实验结果进行判断。
同时按照《食品过敏原胡萝卜成分检测实时荧光PCR方法》进行检测。
2.灵敏度实验
取大豆样品的DNA3份,用胡萝卜的DNA进行添加,制备添加水平为10%、2%、%和%共4个浓度水平的模拟样品DNA。
以胡萝卜过敏原成分含量为10%、2%、%、%和0%的DNA作为模板,进行LAMP等温扩增反应,并对结果进行判断。
同时按照《食品过敏原胡萝卜成分检测实时荧光PCR方法》进行检测。
3.特异性实验
取胡萝卜、芹菜、香菜、茴香、孜然、大豆、玉米的DNA作为模板,进行LAMP等温扩增反应,对结果进行判断。
同时按照《食品过敏原胡萝卜成分检测实时荧光PCR方法》进行检测。
验证数据分析
1、特异性实验结果分析
除胡萝卜检测为阳性外,其他非胡萝卜样品均为阴性,说明该检测方法具有良好特异性。
1、稳定性实验结果表明,使用LAMP检测方法对同一胡萝卜样品的3次检测结果一致,并与实时荧光PCR检测结果相符,该方法具有良好的稳定性。
2、灵敏度实验结果表明,使用LAMP检测方法对%、%、2%和10%胡萝卜含量的模拟样品LAMP检测结果均与样品实际情况相符,并与实时荧光PCR检测结果相符。
该方法对胡萝卜含量为%或以上的样品能够有效检出,灵敏度达到%。
3、特异性实验结果表明,除胡萝卜检测为阳性外,其他非胡萝卜样品均为阴性,没有出现交叉反应,检测结果与实时荧光PCR检测结果相符,该方法具有良好的特异性。
验证评价
山东出入境检验检疫局建立的过敏原胡萝卜成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法具有很好的稳定性和特异性,灵敏度达到%。
该方法快速、简便、灵敏,且无需使用大型仪器设备,适用于食品中胡萝卜过敏原成分的快速筛查检测,适合在基层实验室推广应用。
其他应说明的情况
6附加说明(可选项)
宣贯标准的建议
修订和废除现行有关标准的建议
作为强制性标准或推荐性的建议
其他需要说明的情况
参考文献
联系人
联系电话
电子邮箱
注1:
本模版表的共性部分为第1章、第2章、第4章和第6章。
注2:
适用于标准草案送审稿,适用于标准草案报批稿,中预期的管理目标适用于规程类标准,中技术指标适用于方法类标准,第5章适用于方法类标准编制说明的编写。
注3:
和第6章为可选项,其余为必填项。
编写日期:
XXXX年XX月XX日