食品中过敏原成份环介导等温扩增LAMP检测方式第21部份胡萝卜编制说明.docx

1、食品中过敏原成份环介导等温扩增LAMP检测方式第21部份胡萝卜编制说明食品中过敏原成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第21部分：胡萝卜编制说明1 基本信息 标准草案名称中文食品中过敏原成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法第21部分：胡萝卜英文Loop-mediated isothermal amplification detection method for allergen components in food Part21:Carrot 与国际标准和国外先进标准一致程度情况等同修改非等效标准号/英文名称/中文名称/ 任务来源批准立项的文件名称和文件号关于下达2012年第一批出入境检

2、验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知（国认科201236号）计划编号2012B141 制（修）订情况制订修订替代的标准编号/ 起止时间2012年01月2013年09月 起草单位中国检验检疫科学研究院、山东出入境检验检疫局 起草人孙敏、高宏伟、龚方、刘彩霞 专业类别1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、动物检疫；4、植物检疫；5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10、鉴定；11包装及危险化学品 标准体系表代码 调整情况2 背景情况 目的、意义食物过敏是指致敏机体再次接受食物中相同的过敏原刺激后，由IgE介导的体液免疫反应。这种过敏

3、反应可引发呼吸系统、肠胃系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉和骨骼等不同形式的临床症状，严重的可导致休克甚至死亡。食物过敏至今尚无有效疗法，各过敏原引发过敏反应的最低量尚无定论。在许多情况下，极微量的过敏原即可造成严重后果。目前，预防食物过敏的唯一途径是严防有过敏体质的人接触过敏原。在食品工业日益发达，食品的加工过程和成分日益复杂的今天，食品过敏发病率日益增高，给人们的生命健康造成了巨大威胁，食品过敏已成为WHO和世界粮农组织关注的重大卫生学问题。胡萝卜是一种质脆味美、营养丰富的家常蔬菜，素有“小人参”之称。胡萝卜富含糖类、脂肪、挥发油、胡萝卜素、维生素A、维生素B1、维生素B2、钙、铁等多种营养成

4、分，同时也是一种常见的食物过敏原。有文献报道，胡萝卜、苹果、大豆、榛子、猕猴桃、小麦是柏林人最常见的食物过敏原。瑞士专家报道，大约25%的食物过敏者会对胡萝卜产生过敏反应。亚运食品安全食品过敏原标识标注地方技术规范目前已经实施，规范列出可以导致过敏反应的食品名单，要求含有名单上过敏原的亚运食品必须如实标注，胡萝卜位列其中。本标准选择胡萝卜基因作为检测靶标设计引物，建立检测过敏原胡萝卜成分的LAMP检测方法。该标准的建立对于确保食物标签真实准确，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。 与国内外相关标准、文献的关系胡萝卜过敏原实时荧光PCR检测方法的行业标准已报批、待发布。本标准采用LAMP技

5、术，对仪器要求不高，不需要荧光PCR仪，即可对食品中胡萝卜过敏原进行定性检测。3 编制过程 准备阶段（可选项） 分工情况山东出入境检验检疫局承担引物设计和方法建立工作，中国检验检疫科学研究院承担方法验证工作。 标准草案编写情况完成标准草案的编写。 征求意见情况（适用于送审稿） 完成标准的征求意见。 审定情况（适用于报批稿）完成标准的审定。 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）该方法的检测低限为%（W/W）。4 主要技术内容的确定1、国内外相关的标准要求。2、测定步骤：3、方法灵敏度要求4、提供的图谱：1材料 供试材料不同品系的故萝卜肉质根样本由寿光市胡萝卜基地惠赠。

6、故萝卜种子样本来自山东出入境检验检疫局，为外贸公司自美国、日本、法国、韩国、澳大利亚进口后，送检验检疫局供检验检疫的样品。从当地超市购买含有、可能含有以及不含胡萝卜成分的食品共10种，作为本实验的供试材料，用于分析方法的可行性和灵敏性。从当地超市购买核桃，山核桃，花生，腰果，杏仁，开心果，葵花子，芝麻，栗子，大豆，大麦，小麦，燕麦，黑麦，大米，牛肉，羊肉，猪肉，鸡肉，虾，以及常见的蔬菜，如大白菜，青椒，洋葱，芹菜，黄瓜，其他伞形科植物：八角、茴香、小茴香、孜然，用于分析引物的特异性。 主要试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试剂均用无D

7、NA酶污染的容器分装。检测用引物序列胡萝卜成分LAMP扩增引物详见表1。表1检测用引物 B名称编号序列LAMP引物序列外侧上游引物（F3）5- GAAATTGGCCTCCCGTGC -3外侧下游引物（B3）5- GCTTAAACTCAGCGGGTAGT -3内侧上游引物（FIP）5- AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC -3内侧下游引物（BIP）5- GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA -3上游环引物（LF）5- CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA -3下游环引物（LB）5- GGCCCTTGG

8、GCACAGCAAA -3 Bst DNA聚合酶。1.2.3 dNTP：各25 mmol/L。 CTAB提取缓冲液：CTAB 20 g/L，氯化钠 mol/L，Tris mol/L，Na2EDTA 20 mmol/L，pH ，高压灭菌。使用前加入终浓度为2%的-巯基乙醇。 CTAB沉淀液：CTAB 5 g/L，氯化钠 mol/L，pH ，高压灭菌。 1ThermoPol反应缓冲液：20 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, % Triton X-100。 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（），1 mmol/L

9、EDTA（）。 仪器和设备水浴锅或加热模板：65 1 和80 1 。离心机：最大离心力16000g。微量移液器：10L、100L、200L、1000L。冰箱：2-8，-20。高压灭菌器。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。pH计。天平：感量。2 方法 样品处理称取待测样品10g，用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀。胡萝卜基因组DNA的提取 CTAB法称取经过预处理的待测样本1g，转入15 mL离心管中，半固体样品和液体样品取2 mL4 mL。加入5 mL 65预热的CTAB提取缓冲液和RNA酶（使其终浓度为10 g/mL），颠倒混匀后65温育30min，期间颠倒混匀离心管2次3次；12

10、000g离心10 min，取1mL上清液至2 mL离心管中；加入与上清液等体积的三氯甲烷，颠倒混匀后，12 000g离心10 min，转移上清至新的2mL离心管中；加入2体积CTAB沉淀液，颠倒混匀，室温静置1h；12 000 g离心10 min，弃去上清，加入400 L氯化钠溶液溶解沉淀，加等体积三氯甲烷，颠倒混匀；12 000 g离心10 min，取上层水相到 mL Eppendorf离心管中，加入倍体积4预冷的异丙醇溶液，颠倒混匀，4静置30 min；12 000 g离心10 min，弃去上清液，加入4预冷的70%乙醇500 L，涡旋清洗沉淀；12 000 g离心5 min，弃去上清液，

11、室温条件下过夜或者60烘15-25分钟，注意不要让沉淀过干。加100 LTE缓冲液溶解沉淀，20保存。其他方法待测样品DNA的提取也可用其他等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 DNA浓度的测定取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的吸收值。DNA的浓度按照公式1计算。当浓度为10 g/mL-100 g/mL，A260/A280比值在之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。C=A260N50（1）式中：CDNA浓度（g/mL）A260260 nm处的吸光值N核酸稀释倍数 LAMP定性检测 LAMP反应体系反应体系总体积为25 L，

12、其中含：样品DNA（10 ng/L-100 ng/L）2 L，1ThermoPol 反应缓冲液 L，上游内引物（(Fip，10 mol/L）L，下游内引物（Bip，10 mol/L） L，上游外引物（F3，10 mol/L） L ，下游外引物（B3，10 mol/L） L，上游环引物（LF，10 mol/L） L ，下游环引物（LB，10 mol/L） L ，Bst DNA聚合酶（8 U/L）1 l，dNTP（各25 mmol/L） L， 甜菜碱（5 mol/L）4 L ，硫酸镁（100 mmol/L） L ，水 L。2.3.2 LAMP反应参数63 恒温扩增60 min，80 5 min使酶

13、灭活，反应结束。三、方法灵敏度要求目前国内外针对食品过敏原成分检测方法灵敏度没有统一要求。分子生物学方法灵敏度一般超过实际产品检测需求。本方法绝对检测灵敏度为2 pg DNA，相对灵敏度为%（W/W）。四、实验结果1、LAMP（）特异性选择常见的食品原料，包括粮食（大豆，大麦，小麦，燕麦，黑麦，大米）、动物组织（牛、羊、猪鸡、虾）、坚果（胡桃、山核桃、花生、腰果、杏仁、开心果，葵花子，）、蔬菜（大白菜，青椒，洋葱，黄瓜）、其他伞形科植物（孜然、香芹、香菜、小茴香、茴香等）提取DNA，按照中的方法，进行LAMP反应。.检测上述物种的结果均为阴性，与预期相符，表明该组引物和探针有良好的特异性，与上

14、述物种没有交叉反应。（）灵敏度随机取一种胡萝卜的DNA溶液（浓度为10 ng/L）用大豆DNA溶液（浓度为10 ng/L）进行10梯度系列稀释后，进行LAMP检测。结果表明：当DNA稀释至10-5，浓度为1 pg/L，反应液中DNA低至2 pg时，仍能检出。据此，可推算出，该方法的检测低限为%图1不同稀释度胡萝卜DNA溶液的LAMP检测凝胶电泳图谱从左到右胡萝卜DNA浓度依次为：10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg 2、实际样品检测结果（1）新鲜胡萝卜收集了不同品系的11个胡萝卜肉质根样本（红春秀、红映2号、明福春红、世农春90、世农春王早生、红贵208、世农415、孟德尔

15、808、长生7585、早春红冠、红星改良五寸），取其可食用肉质根，提取DNA， LAMP扩增后，进行凝胶电泳。实验结果显示，11个样本均产生典型的梯状条带。见图3。图2 新鲜胡萝卜的LAMP检测电泳图谱 （2）胡萝卜种子样品 收集自美国、日本、法国、韩国、澳大利亚进口的胡萝卜种子，提取DNA，进行检测。种子样本全部产生典型的阳性扩增。部分结果见图3。从左到右依次为美国、日本、法国、韩国、澳大利亚进口种子样本。图3 胡萝卜种子的LAMP检测电泳图谱1、美国；2、日本；3、法国；4、韩国；5、澳大利亚；6、阴性对照；7、阳性对照（2）胡萝卜制品自超市购买8种食品（5种食品的标签标示为：含有胡萝卜成

16、分；3种食品无相关标示），提取核酸，使用胡萝卜特异的引物，进行LAMP反应。实验结果显示，其中的5种食品含有胡萝卜成分，见表2，图4。表2 不同食品的实时荧光PCR扩增结果样品胡萝卜成分标示LAMP 结果四海春牌饺子含有检出包子（超市自制）含有检出康师傅方便面调料包含有检出方广儿童胡萝卜面含有检出君盛胡萝卜面含有检出亨氏猪肝蔬菜营养米粉N未检出亨氏番茄米粉N未检出百乐麦乖乖面N未检出 N: 无相关标识图4胡萝卜制品的LAMP检测电泳图谱1、亨氏猪肝蔬菜营养米粉；2、康师傅方便面调料包；3、包子；4、四海春牌饺子；5、君盛胡萝卜面；6、方广儿童胡萝卜面；7、亨氏番茄米粉；8、百乐麦乖乖面5 验证

17、情况（适用于方法类标准） 验证单位情况必填验证单位验证人员验证时间XXXX年XX月XX日XXXX年XX月XX日XXXX年XX月XX日XXXX年XX月XX日XXXX年XX月XX日XXXX年XX月XX日XXXX年XX月XX日 验证过程采用山东出入境检验检疫局提供的引物、实验材料及实验方法，对该方法进行验证：1.稳定性实验取阳性胡萝卜15号的DNA作为模板，进行LAMP等温扩增反应，共进行3次实验，并对实验结果进行判断。同时按照食品过敏原胡萝卜成分检测 实时荧光PCR方法进行检测。2.灵敏度实验取大豆样品的DNA 3份，用胡萝卜的DNA进行添加，制备添加水平为10%、2%、%和%共4个浓度水平的模拟

18、样品DNA。以胡萝卜过敏原成分含量为10%、2%、%、%和0%的DNA作为模板，进行LAMP等温扩增反应，并对结果进行判断。同时按照食品过敏原胡萝卜成分检测 实时荧光PCR方法进行检测。3.特异性实验取胡萝卜、芹菜、香菜、茴香、孜然、大豆、玉米的DNA作为模板，进行LAMP等温扩增反应，对结果进行判断。同时按照食品过敏原胡萝卜成分检测 实时荧光PCR方法进行检测。 验证数据分析1、特异性实验结果分析除胡萝卜检测为阳性外，其他非胡萝卜样品均为阴性，说明该检测方法具有良好特异性。1、稳定性实验结果表明，使用LAMP检测方法对同一胡萝卜样品的3次检测结果一致，并与实时荧光PCR检测结果相符，该方法具

19、有良好的稳定性。2、灵敏度实验结果表明，使用LAMP检测方法对%、%、2%和10%胡萝卜含量的模拟样品LAMP检测结果均与样品实际情况相符，并与实时荧光PCR检测结果相符。该方法对胡萝卜含量为%或以上的样品能够有效检出，灵敏度达到%。3、特异性实验结果表明，除胡萝卜检测为阳性外，其他非胡萝卜样品均为阴性，没有出现交叉反应，检测结果与实时荧光PCR检测结果相符，该方法具有良好的特异性。 验证评价山东出入境检验检疫局建立的过敏原胡萝卜成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法具有很好的稳定性和特异性，灵敏度达到%。该方法快速、简便、灵敏，且无需使用大型仪器设备，适用于食品中胡萝卜过敏原成分的快速筛查检测，适合在基层实验室推广应用。 其他应说明的情况6 附加说明（可选项） 宣贯标准的建议 修订和废除现行有关标准的建议 作为强制性标准或推荐性的建议 其他需要说明的情况 参考文献联系人联系电话电子邮箱注1：本模版表的共性部分为第1章、第2章、第4章和第6章。注2：适用于标准草案送审稿，适用于标准草案报批稿，中预期的管理目标适用于规程类标准，中技术指标适用于方法类标准，第5章适用于方法类标准编制说明的编写。注3：和第6章为可选项，其余为必填项。编写日期：XXXX年XX月XX日