丙烯腈对大鼠血清性激素的影响.docx
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丙烯腈对大鼠血清性激素的影响
丙烯腈对大鼠血清性激素的影响
目的探讨丙烯腈（acrylonitrile，ACN）对大鼠血清性激素水平影响的动态变化。
方法将24只成年健康的SPF级SD大鼠，按体重随机分为对照组（5ml/kg.bw玉米油）、低剂量组（12.5mg/kgACN）、中剂量组（25mg/kgACN）高剂量组（50mg/kgACN）4组，对各组大鼠分别给予玉米油和不同浓度的ACN灌胃，1次/d，连续灌胃12周，每两周心脏采血一次，12周时麻醉采血后脱臼处死，共7次采血。
将血样离心后取血清，用放射免疫分析法（RIA）测定睾酮（T）、间质细胞刺激素（ICSH）、促卵泡激素（FSH）和雌二醇（E2）。
结果不同染毒组之间大鼠体重差异无统计学意义（P>0.05）。
不同染毒组大鼠在不同时间点的T、ICSH、FSH、E2水平差异都有统计学意义，其中ICSH和E2在处理组与时间点之间有交互作用，而T和FSH未见有交互作用。
（1）染毒第4、6、10周，低、中、高剂量组的T水平均低于阴性对照组（P<0.05）。
（2）染毒第2周，中、高剂量组ICSH水平低于对照组（P<0.05）；染毒第12周，ACN中、高剂量组也低于对照组（P<0.05）。
（3）染毒第6周，中、高剂量组FSH水平均低于对照组（P<0.05）；染毒第8周，高剂量组FSH也低于对照组（P<0.05）。
（4）染毒第2周，中剂量组E2水平低于对照组（P<0.05）；染毒第6周，高剂量组E2低于对照组（P<0.05）；染毒第12周，低、中、高剂量组E2与对照组比较均下降（P<0.05）。
结论在本次实验条件下，随着ACN染毒剂量的增加，血清T、ICSH、FSH和E2水平在一定时间内有下降趋势，但非直线下降，而呈一定的波动。
丙烯腈（acrylonitrile，ACN）是一种工业化的腈类化合物，作为中间产物被广泛应用于生产聚丙烯腈纤维、塑料、合成橡胶、粘合剂和农药杀虫剂。
除此之外，ACN聚合物与ACN衍生物也广泛应用于国民经济的多个领域[1]。
接触和使用包含有ACN或其相关产物，可能会产生潜在的ACN暴露影响。
在临床应用上，ACN也被应用于医用生物材料的合成，包括高透性的透析管[2]和封装移植朗格汉斯胰岛的人工膜[3]。
另外，ACN也存在于饮用水、香烟烟雾、食物和某些职业环境中。
有研究发现ACN的职业性暴露导致工人癌症发生率的上升，尤其是肺癌、胃肠癌和造血淋巴系统癌症[4]。
国际癌症研究机构（TheInternationalAgencyforResearchonCancer，IARC）将ACN归入“可能致癌物”一类中[5]。
ACN具有急性毒性。
美国国家职业安全与健康研究所（the AmericaNationalInstituteforOccupationalSafetyandHealth）推荐的ACN的容许暴露水平（1ppm浓度）相对较低，在通过皮肤意外暴露情况下就会使体内达到高暴露水平[6]。
职业流行病学调查和实验研究表明，ACN对肝脏、外周血细胞、免疫功能、神经系统功能等具有明显影响；在远期效应方面，国内外的研究趋于认为ACN具有致突变性、致畸性、致癌性、免疫毒性和血液毒性作用[7]。
一项早期的研究证明ACN可在血液中保持较高水平，这表明ACN在大鼠的肝脏、脾脏、骨髓、肺和脂肪组织中发生了代谢性的合成，并且可与体内大分子发生相互作用；先前的研究也表明ACN对造血细胞基因转录和蛋白质表达的影响，可能会干扰造血细胞的增殖活性和其复杂的监管途径[8]。
肖卫等研究表明ACN会影响作业女工的月经机能和生殖机能；对作业男工妻子的生殖功能也有一定影响[9]。
金沈雄等研究显示ACN及其代谢产物（CEO）能诱导男工血清中促卵泡生成激素、睾酮和雌二醇激素水平发生改变，提示接触ACN可能导致睾丸支持细胞和间质细胞损伤[10]。
因此，本研究拟通过不同剂量ACN对成年雄性大鼠进行灌胃，观察期为12周，每2周心内采血1次，动态观察血清中睾酮（T）、间质细胞刺激素（ICSH）、促卵泡生成激素（FSH）和雌二醇（E2）水平的变化，探讨ACN亚慢性作用对生殖内分泌的影响及其周期性变化，旨在为ACN对雄性生殖毒作用的深入研究提供一定的线索。
1.实验材料、仪器及方法
1.1实验材料和仪器
1.1.1实验动物
健康成年SPF级SD雄性大鼠24只，体重280.11±25.66g，6-8周龄[动
物合格证号：
SCXK（甘）2011-0001-62001000000102]，购买于甘肃中医学院医学实验动物中心[实验中心合格证号：
SCXK（甘）2011-0001-00000125]。
大鼠全程均饲养于甘肃中医学院医学实验动物中心SPF级实验室，温度22±1℃，湿度50%，12小时昼夜交替，普通饲料喂养，自由饮食。
1.1.2实验仪器与材料
GC-1200y放射免疫计数器（中国科学技术大学科技实业总公司中信光电仪
器分公司），LD4-2离心机（北京医用离心机厂），DK-600S型三用恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司），EDTA真空抗凝管。
1.1.3实验试剂
丙烯腈（中国石化兰州分公司）纯度99.99%；玉米油（金龙牌食用玉米油），购于华润万家超市；乙醚，纯度99.9%。
T、ICSH、FSH和E2放射免疫分析试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1实验分组及给药
将ACN溶于玉米油，配成12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg的ACN溶液。
将24只大鼠按体重随机分为对照组（玉米油）、低剂量组（12.5mg/kgACN）、中剂量组（25mg/kgACN）和高剂量组（50mg/kgACN）组，每组6只，分别给予5ml/kg.bw玉米油和ACN溶液灌胃，1次/天，连续灌胃12周。
大鼠每3天称重1次。
1.2.2采血及血清制备
用脱脂棉蘸取少许乙醚，放入干燥缸中，然后将大鼠放入3~5分钟，观察无角膜反射时，迅速取出大鼠，置于工作台上，仰卧固定四肢，75%乙醇消毒，沿胸骨柄剑突下潜行进针，右心室采血2ml，迅速拔针后按压止血，将大鼠置于通风处清醒。
血液3000转离心5分钟，分离血清置于-20°C保存待测。
实验开始前采血1次，记为t0，以后每两周采血1次，记为t1~t6，共采血7次。
1.2.3测定指标
用碘[125I]放射免疫分析法（RIA）测定T、ICSH、FSH和E2的血清激素水平，实验步骤完全按试剂盒说明书步骤操作。
1.2.4统计方法
检测数据输入Excel进行整理，采用SPSS18.0进行数据分析，用一般线性模型（GeneralLinearModel）中RepeatedMeasures进行方差分析；每个分组（对照组和3个染毒组）在7个时间点上的两两比较时，先按分组对数据文件进行拆分，再进行RepeatedMeasures方差分析；每个时间点上4个分组之间的两两比较，用Multivariate分析。
2.结果
2.1大鼠体重变化
各染毒组大鼠体重随时间变化曲线图，见图2.1。
图2.1不同染毒组ACN对雄性大鼠体重的影响12周（84天）观察结果
由图1可见，随着时间的增加，各组大鼠体重都增加，趋势一致，在35天时，高剂量组大鼠体重有所下降，低剂量组有所升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2丙烯腈对大鼠血清性激素影响的相关性分析
2.2.1丙烯腈对T水平的影响
由表2.1可知，经Mauchly’s球型度检验，球形不对称（P<0.001），需参考Greenbouse-Geisser调整概率[11]。
不同剂量组大鼠在不同时间点的T均值的差异有统计学意义，随灌胃时间的增加，T水平降低（P<0.001）。
处理组与时间点之间无交互作用（P=0.372）。
结合表中组间差别的检验结果和血清T浓度水平变化趋势，不同剂量ACN处理组的T浓度的主效应未见差异（P=0.278）。
所以，可以认为不同剂量的ACN对血清T浓度水平影响未见不同，但不同剂量的ACN在7个时间点上对血清T浓度水平的影响有差异。
表2.10~12周大鼠T水平的方差分析表
变异来源
自由度
离均差平方和
均方
F
P
调整概率
G-G
H-F
处理组（A）
3
101251.469
33750.490
1.449
0.278
组间对象误差
12
279517.325
23293.110
时间（B）
6
5164103.847
860683.975
40.730
<0.001
<0.001
<0.001
A*B交互作用
18
434937.319
24163.184
1.143
0.331
0.372
0.371
组内重复误差
72
1521462.952
21131.430
注：
Mauchly’s球型度检验：
=125.792，P<0.001，G-Ge=0.201，H-Fe=0.267
2.2.2丙烯腈对ICSH水平的影响
由表2.2可知，经Mauchly’s球型度检验，球形不对称（P<0.001），需参考Greenbouse-Geisser调整概率[11]。
不同染毒组大鼠在不同时间点的ICSH水平差异有统计学意义，随灌胃时间的增加，ICSH水平降低（P<0.001）。
染毒组与时间点之间有交互作用（P<0.05）；不同染毒组之间ICSH浓度水平差异有显著性，各组大鼠ICSH水平的变化趋势不同。
表2.20~12周大鼠ICSH水平的方差分析表
变异来源
自由度
离均差平方和
均方
F
P
调整概率
G-G
H-F
处理组（A）
3
30.530
10.177
0.892
0.473
组间对象误差
12
136.933
11.411
时间（B）
6
1353.154
225.526
26.709
<0.001
<0.001
<0.001
A*B交互作用
18
460.859
25.603
3.032
<0.001
0.015
0.003
组内重复误差
72
607.945
8.444
注：
Mauchly’s球型度检验：
=65.975，P<0.001，G-Ge=0.411，H-Fe=0.654
2.2.3丙烯腈对FSH水平的影响
由表2.3可知，经Mauchly’s球型度检验，球形不对称（P<0.001），需参考Greenbouse-Geisser调整概率[11]。
不同剂量组大鼠在不同时间点的FSH均值的差异有统计学意义，随灌胃时间的增加，FSH水平降低（P<0.05）。
处理组与时间点之间未见交互作用（P=0.055）。
结合表中组间差别的检验结果和血清FSH浓度水平变化趋势，不同剂量ACN处理组的FSH浓度的主效应未见差异（P=0.151）。
所以，可以认为不同剂量的ACN对血清FSH浓度水平影响未见不同，但不同剂量的ACN在7个时间点上对血清FSH浓度水平的影响有差异。
表2.30~12周大鼠FSH水平的方差分析表
变异来源
自由度
离均差平方和
均方
F
P
调整概率
G-G
H-F
处理组（A）
3
100.412
33.471
2.121
0.151
组间对象误差
12
189.410
15.784
时间（B）
6
1042.019
173.670
10.727
<0.001
0.002
<0.001
A*B交互作用
18
794.466
44.137
2.726
0.001
0.055
0.032
组内重复误差
72
1165.726
16.191
注：
Mauchly’s球型度检验：
=77.267，P<0.001，G-Ge=0.256，H-Fe=0.359
2.2.4丙烯腈对E2水平的影响
由表2.4可知，经Mauchly’s球型度检验，球形对称（P=0.233），无需调整概率[11]。
不同剂量组大鼠在不同时间点的E2均值的差异有统计学意义，随灌胃时间的增加，E2水平降低（P<0.001）。
处理组与时间点之间有交互作用（P<0.001），不同剂量组之间E2浓度水平差异有显著性，各组大鼠E2水平的变化趋势不同。
因存在处理组与时间点间的交互作用，此时不考虑各组间的主效应[11]（P=0.014）。
所以，可以认为接触ACN会使雄性大鼠的血清E2水平降低，尤其当接触较低剂量时，血清E2水平降低较为明显。
表2.40~12周大鼠E2水平的方差分析表
变异来源
自由度
离均差平方和
均方
F
P
调整概率
G-G
H-F
处理组（A）
3
1443.525
481.175
5.359
0.014
组间对象误差
12
1077.409
89.784
时间（B）
6
3072.720
512.120
9.271
<0.001
<0.001
<0.001
A*B交互作用
18
6344.897
352.494
6.381
<0.001
<0.001
<0.001
组内重复误差
72
3977.321
55.241
注：
Mauchly’s球型度检验：
=24.773，P=0.233，G-Ge=0.642，H-Fe=1.000
2.3不同染毒组大鼠血清激素水平随时间变化分析
2.3.1T水平随时间变化趋势
图2.2血清T浓度随时间变化趋势
由图2.2可知，ACN不同染毒组大鼠的T水平与灌胃前比较均呈现不同程度的下降趋势。
对照组大鼠T水平总体呈下降趋势，染毒初期持续下降，中期有所波动，6周时T水平降至最低，与灌胃前比较有统计学差异（P<0.05）；随后有所回升，10周的T水平与4周、8周时比较，差异有统计学差异（P<0.05），但相较灌胃前水平仍然有所降低。
各染毒组大鼠的T水平下降趋势明显：
①低剂量组大鼠染毒后各时间点T水平均低于灌胃前，差异有统计学意义（P<0.01）；4~12周的T水平均低于2周时，差异有统计学意义（P<0.05）。
②中剂量组大鼠染毒后各时间点T水平也都低于灌胃前，差异有统计学意义（P<0.05）；T水平在4周、6周时降低明显，与2周时比较，差异有统计学意义（P<0.05）；6周后T水平有所上升，8~12周的T水平高于4周和6周时，差异有统计学意义（P<0.05）。
③高剂量组大鼠染毒后T水平较灌胃前均有所下降，波动不明显，其中10周高于4周有统计学意义（P<0.05）。
2.3.2ICSH水平随时间变化趋势
图2.3血清ICSH浓度随时间变化趋势
由图2.3可知，ACN不同染毒组大鼠的ICSH水平总体波动较大，染毒初期有所上升，随后均有不同程度的下降，与对照组变化趋势相同。
对照组大鼠灌胃后持续上升，至4周时达到峰值，而后开始下降，8~12周时的ICSH水平降低明显，与2周和4周比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
低剂量组10~12周时的ICSH水平下降较多，与2周和6周比较，有统计学意义（P<0.05）。
中剂量组4周时的ICSH水平最高，8~12周时降低与4周时比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
高剂量组6周时的ICSH水平升至最高，8~12周下降幅度大，但差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3.3FSH水平随时间变化趋势
图2.4血清FSH浓度随时间变化趋势
由图2.4可知，ACN不同染毒组大鼠的FSH水平在染毒初期有所上升，随后都呈现下降趋势。
对照组各时间点之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
各染毒组在灌胃初期都出现不同幅度的升高，其中高剂量组在2周时的FSH水平高于灌胃前，差异有统计学意义（P<0.05），其余三组均在2~4周出现FSH高峰值。
随着灌胃时间的增加，各组都出现下降趋势：
低剂量组FSH水平10周时低于4周时，差异有统计学意义（P=0.005）。
中剂量组10~12周的FSH水平均低于2周时，差异有统计学意义（P<0.05）；6~12周均低于4周时，差异有统计学意义（P<0.05）；12周低于8周时，差异有统计学意义（P<0.05）。
高剂量组4~12周持续降低，与2周时FSH比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
此外，12周低于灌胃前、6周和8周，差异也有统计学意义（P<0.05）。
2.3.4E2水平随时间变化趋势
图2.5血清E2浓度随时间变化趋势
由图2.5可知，不同染毒组的E2水平波动较大。
对照组在初期开始下降后，8~12周明显上升。
8周时的E2水平低于灌胃前、灌胃后2周和4周，差异有统计学意义（P<0.05）；12周时高于6周和8周，差异有统计学意义（P<0.05）。
除8周和12周时的E2水平波动较大外，各时间点的E2水平之间均无统计学意义。
低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠的E2水平在初期都有不同程度的上升，8~12周时三组的E2水平均有所波动，但总体呈现下降趋势。
其中，低剂量组8~12周时的E2水平均低于灌胃前，差异有统计学意义（P<0.05）；6~12周均低于2周时，差异均有统计学意义（P<0.05）；8~12周均低于4周时，差异均有统计学意义（P<0.05）。
中剂量组4周和6周的E2水平高于灌胃前，差异均有统计学意义（P<0.05）；6~12周均低于4周时，差异有统计学意义（P<0.05）；8周和10周时均低于6周时，差异有统计学意义（P<0.01）。
高剂量组中E2水平2周、10周均高于6周和12周，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4不同时间点各染毒组大鼠血清激素水平变化分析
2.4.1不同时间点ACN对大鼠T水平的影响
灌胃前、灌胃后2周、8周、12周时各组之间T水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
灌胃后4周、6周、10周，低、中、高剂量组的T水平均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
另外，10周时，中、高剂量组的T水平高于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。
表2.5不同时间点ACN对T水平影响的比较（
）单位：
ng/dl
时间
n
对照组
低剂量组
中剂量组
高剂量组
灌胃前
6
621.66±270.36
764.06±186.72
961.12±381.77
593.65±524.15
灌胃后2周
6
163.92±99.62
207.74±56.05
157.02±39.41
131.34±94.09
灌胃后4周
6
152.60±38.98
70.51±15.14*
36.22±20.03*
63.95±20.82*
灌胃后6周
6
151.44±21.50
93.40±37.40*
58.58±10.14*
84.95±18.01*
灌胃后8周
6
158.29±40.68
94.47±12.73
119.76±20.07
95.66±81.94
灌胃后10周
6
266.80±44.45
62.25±9.76*
151.45±27.15*#
138.24±33.82*#
灌胃后12周
6
209.34±155.07
98.43±38.55
182.21±57.29
95.75±42.96
注：
*表示与对照组比较P<0.05；#表示与低剂量组比较P<0.05
2.4.2不同时间点ACN对大鼠ICSH水平的影响
灌胃前、灌胃后4周、6周、10周时各染毒组之间ICSH水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
灌胃后2周，中、高剂量组的ICSH水平均低于对照组与低剂量组，差异有统计学意义（P<0.005）。
灌胃后12周，中剂量组和高剂量组的ICSH水平均低于对照组，差异有统计学意义（P=0.007）。
表2.6不同时间点ACN对ICSH水平影响的比较（
）单位：
mIU/ml
时间
n
对照组
低剂量组
中剂量组
高剂量组
灌胃前
6
4.76±2.36
3.30±1.21
4.59±2.60
5.07±2.14
灌胃后2周
6
6.81±0.89
8.62±3.29
2.46±1.29*#
2.22±0.87*##
灌胃后4周
6
12.08±6.53
6.15±2.87
10.48±2.13
9.74±3.46
灌胃后6周
6
5.16±1.25
12.87±7.40
5.43±1.95
13.68±8.78
灌胃后8周
6
1.78±0.57
3.85±2.71
1.83±1.09
0.21±0.06#
灌胃后10周
6
0.51±0.43
0.52±0.61
0.86±0.81
0.52±0.59
灌胃后12周
6
1.54±0.28
0.91±0.80
0.39±0.15*
0.49±0.27*
注：
*表示与对照组比较P<0.05；#，##表示与低剂量组比较P<0.05,P<0.001；&表示与中剂量组比较P<0.05。
2.4.3不同时间点ACN对大鼠FSH水平的影响
灌胃前、灌胃后4周、10周时各组之间FSH水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
灌胃后2周，高剂量组的FSH水平高于低、中剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。
灌胃后6周，中、高剂量组的FSH水平均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
灌胃后8周，高剂量组的FSH水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
灌胃后12周，低剂量组的FSH水平高于对照组、中、高剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。
表2.7不同时间点ACN对FSH水平影响的比较（
）单位：
mIU/ml
时间
n
对照组
低剂量组
中剂量组
高剂量组
灌胃前
6
2.31±1.08
2.43±1.64
3.54±2.07
2.40±0.76
灌胃后2周
6
15.38±16.80
4.77±1.76
4.03±1.49
19.39±7.43#&
灌胃后4周
6
6.66±5.31
5.43±3.09
6.35±2.37
2.82±1.61
灌胃后6周
6
6.15±4.41
4.24±1.15
2.00±1.77*
1.33±0.63*
灌胃后8周
6
4.39±3.30
3.46±2.23
1.77±0.42
1.21±0.28*
灌胃后10周
6
1.15±0.30
0.97±0.82
0.89±0.58
1.38±1.02
灌胃后12周
6
1.70±0.52
5.40±3.32*
0.57±0.37#
0.62±0.39#
注：
*表示与对照组比较P<0.05；#表示与低剂量组比较P<0.05；&表示与中剂量组比较P<0.05
2.4.4不同时间点ACNE2对大鼠E2水平的影响
灌胃后8周时各组之间E2水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
灌胃前，中剂量组的E2水平低于对照组（P=0.014），中、高剂量组的E2水平均低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。
灌胃后2周，中剂量组的E2水平低于对照组、低剂量
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