大肠埃希菌检查法.docx

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大肠埃希菌检查法

大肠埃希菌查抄法之五兆芳芳创作

EscherichiaColiTestMethod

1.目的

成立大肠埃希菌查抄法的尺度操纵程序.

适用于大肠埃希菌查抄的操纵.

QC化验员.

4.程序：

.大肠埃希菌（Escherichiacoli）即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种.埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发明有非脱羧埃希氏菌等5个种.大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外.在药品中检出大肠埃希菌，标明该样品受到人和温血动物的粪便污染，便可能污染肠道病原体.大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人迸发性腹泻.为包管人体安康，口服药品必须查抄大肠埃希菌.

.用4-甲基伞形酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）和靛基质（Indole）试验查抄大肠埃希菌是一项新技巧，其查验步调为：

增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混杂菌中别离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性便可陈述结果.

.原理：

利用目标菌限定酶作用的底物的水解产品，产生颜色或荧光反响作为指示系统来判定目标菌.

实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD），约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶.MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反响的敏感度较颜色反响强千万倍，易于不雅察，没有主不雅性，因而用MUG判定大肠埃希菌已被普遍应用于临床、食品、饮水、污水等的检测.单一的MUG辨别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提矮小肠埃希菌的检出率.如MUG与Indole试验的反响不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板别离培养、革兰染色、镜检及生化试验辨别.该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％.如仅用IMViC生化试验来辨别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含糊的.

4.2.仪器、设备及用具

.无菌室

.净化任务台

.培养箱（36±1℃）

.高压蒸汽灭菌器

.显微镜（1500X）

.微波炉

.恒温水浴（45±1℃）

.离心机（500～4000r/min）

.μm±μm薄膜及过滤器

.电冰箱

.匀浆仪

.366nm紫外灯

.玻璃器皿、器具

4.3.试液、指示液

.0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟.

.靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛，参加戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛，参加95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入.

.甲基红指示液取甲基红，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得.

.V-P试液

α-萘酚乙醇试液：

取α－萘酚，加无水乙醇溶解使成100ml.

氢氧化钾试液：

取氢氧化钾、加水使溶解成100ml.

.革兰染色液

.1.结晶紫染液取结晶紫、95％乙醇20ml、1％草酸铵[（NH4）2C2O4]溶液80ml.将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混杂，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月.

.2.革兰碘液碘、碘化钾、蒸馏水300ml.用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用.

.3.脱色液95％乙醇

.4.沙黄（番红）染液沙黄（SafranineO）、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄参加乙醇中，完全溶解后再加水至100ml.

.亚甲蓝指示液取亚甲蓝，加水溶解使成100ml.

.溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml.变色规模pH6.0～7.6（黄→红）

.酸性品红指示液取酸性品红，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于滚水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得.变色规模pH6.0～7.4（黄→红）.

.曙红钠指示液取曙红钠，加水溶解使成100ml.

.无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯801ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟.

.无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）取磷酸氢二钠与磷酸二氢钠，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟.

.无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸，参加含10ml水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟.

.中性红指示液取中性红，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml.变色规模

Ph6.8～8.0（红→黄）.

.无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）取磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钠，蛋白胨，加水1000ml，加热使溶解，过滤.分装，灭菌.

4.4.培养基

.营养肉汤培养基

胨10g氯化钠

牛肉浸出粉水1000ml

±0.2，分装，灭菌.

.营养琼脂培养基

胨10g氯化钠

牛肉浸出粉水1000ml

琼脂

±0.2，分装，灭菌.

.胆盐乳糖培养基（BL）

胨磷酸二氢钾

乳糖牛胆盐

氯化钠（或去氧胆酸钠）（）

磷酸氢二钾水1000ml

±0.2，煮沸，滤清，参加乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌.

.4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β-D-glu-curonide,MUG）培养基

胨磷酸二氢钾（无水）

硫酸锰磷酸氢二钠（无水）

硫酸锌亚硫酸钠40mg

硫酸镁去氧胆酸钠

氯化钠MUG75mg

氯化钙50mg水1000ml

±0.1，参加MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌.

.曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）

营养琼脂培养基100ml曙红钠指示液2ml

20%乳糖溶液5ml亚甲蓝指示液

取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操纵参加灭菌的其他

3种溶液，摇匀，倾注平皿.

.麦康凯琼脂培养基（MacC）

胨1%中性红指示液3ml

乳糖琼脂

牛胆盐水1000ml

氯化钠

±0.2，参加琼脂，加热溶化后，再参加其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿.

.蛋白胨水培养基

胰蛋白胨10g

氯化钠5g

水1000ml

±0.1，分装于小试管，灭菌.

.磷酸盐葡萄糖胨水培养基

胨7g磷酸氢二钾（K2HPO4）2g

葡萄糖5g水1000ml

±0.1，分装于小试管，灭菌.

.枸橼酸盐培养基

氯化钠5g枸橼酸钠（无水）2g

硫酸镁（MgSO4·7H2O）溴麝香草酚蓝指示液20ml

磷酸氢二钾（K2HPO4）1g琼脂14g

硫酸二氢铵（NH4H2PO4）1g水1000ml

±0.1，参加琼脂，加热溶化，参加指示液，混匀.分装于小试管，灭菌，制成斜面.注：

所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗.

.乳糖培养基

胨乳糖

0.04%溴甲酚紫指示液25ml水1000ml

±0.2，参加指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml.灭菌.

5%乳糖培养基

胨

溴麝香草酚蓝指示液6ml

氯化钠乳糖5g

磷酸氢二钠水100ml

除乳糖和指示液外，混杂各成分，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.4，参加乳糖/指示液，混杂，分装于含小倒管的灭菌小试管中，115℃灭菌15min.

4.5.对照用菌液

取大肠埃希菌[CMCC（B）44102]的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置36±1℃培养18～24小时，取均匀培养物1ml用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定.

4.6.准备

.查验量

.1.每批供试品查验量，一般为10g或10ml，特殊宝贵或微量包装的供试品查验量可以酌减.

.2.供试品均须取自2个以上的包装单位.

.供试液的制备

.1.液体供试品取供试品10ml，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）至100ml，混匀，作为供试液.

.2.固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其他有效的办法，混匀，作为供试液.需要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分离均匀.

.3.非水溶性供试品

办法1取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超出45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混杂物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢参加45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：

20的供试液.

办法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见无菌查抄法中供试品的无菌查抄项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，需要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解.然后参加45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5-10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：

10的供试液.

以上供试品如吸水膨胀，或粘度太高，可增加稀释剂的量，制成1：

20～1：

100供试液.

.4.含抑菌成分供试品

供试品按常规查抄法，参加规则量的对照菌，不克不及检出时，标明供试品有抑菌活性.该供试液按以下办法之一或两种以上办法联合处理后，依法查抄.同时做阳性和阴性对照.

稀释法取规则量的供试液接种到较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度.

离心沉法取一定量的供试液，500转/别离心3分钟，取全部上清液混杂.用于细菌查抄.

薄膜过滤法取规则量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操纵参加装有直径为47mm、孔径不大于±μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次良多于100ml，将培养基参加滤器或取出滤膜，参加增菌培养基中.

中和法取规则量含磺胺类的供试品，于100ml增菌液（含1％对氨基苯甲酸约1～5ml）中，含砷、汞类的供试品，于硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰供试品，于含适量聚山梨酯80等概略活性剂的100ml增菌液中（概略活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用）.

沉降法取规则量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂.

4.7.查抄办法验证

在成立供试品的大肠埃希菌查抄法或原查抄法的查验条件产生改动可能影响查验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及查抄法的可靠性进行验证.验证试验按供试液的制备和大肠埃希菌查抄法所规则的办法进行.

.验证办法

.1.试验组取规则量供试液及10-100cfu试验菌参加增菌培养基中，依大肠埃希菌查抄法进行查抄.当采取薄膜过滤法时，取规则量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接种到增菌培养基中.

.2.阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证大肠埃希菌查抄法的专属性.办法同试验组，验证大肠埃希菌时的阴性对照菌采取金黄色葡萄球菌.阴性对照菌不得检出.

.结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌.若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和大肠埃希菌查抄法进行供试品的大肠埃希菌查抄；若试验组未检出试验菌，应采取培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等办法或联合使用这些办法消除供试品的抑菌活性，偏重新进行办法验证.

验证试验也可与供试品的大肠埃希菌查抄同时进行.

4.8.操纵步调

.查验程序

.1.阳性对照试验各供试品进行大肠埃希菌查抄时，应做阳性对照试验.阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，供试品和增菌培养基用量及查抄按供试品的大肠埃希菌查抄.阳性对照试验应查抄出大肠埃希菌.已做验证试验的供试品，在该供试品查抄时不必再做阳性对照.

.2.阴性对照试验取稀释剂10ml参加100ml（或200ml）大肠埃希菌查抄用的增菌培养基中，培养，应无菌生长.

.增菌培养

.1.取胆盐乳糖（BL）培养基2份，每份各100ml.1份参加10ml供试液（相当于供试品1g、1ml、10cm2），另1份参加与供试液等量的稀释剂作阴性对照.培养18～24小时，需要时可延长48小时），阴性对照应无菌生长.

.2.取上述培养物，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下不雅察，同时取未接种的MUG培养基作本底对照.在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性.不雅察后，沿培养管的管壁参加数滴靛基质试液，液面呈玫瑰白色，为靛基质阳性；呈试剂赋性，为靛基质阴性.本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性.如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌.

.别离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环1～2ml环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24小时.若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌.

表1大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂

呈紫玄色、浅紫色、蓝紫色或粉白色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边沿整齐，概略滑腻，湿润，常有金属光泽

麦康凯琼脂

鲜桃白色或微白色，菌落中心呈深桃白色，圆形，扁平，边沿整齐，概略滑腻，湿润

当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行别离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌.

为了标准操纵，以下是对药典要求的弥补.

.纯培养如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的概略中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，辨别接种营养琼脂斜面，培养18～24h，作以下查抄.

如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫玄色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养18～24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下查抄.

.革兰染色、镜检

.1.以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温枯燥，再通过分焰2～3次（载玻片烫手）固定.

.2.滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗.

.3.滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水.

.4.滴加95％乙醇，脱色20～30秒钟，水洗.

.5.滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检.

.6.染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰氏阴性呈白色.大肠埃希菌为革兰阴性短埃希菌，或球埃希菌状，亦有埃希菌状.

.7.注意事项

（1）玻片必须洁净，无划痕.涂片的菌量宜少，菌不成浓.不然，菌细胞成堆或连成片.倒霉菌细胞染色反响判断及形态不雅察.

（2）培养物的菌龄以16～24小时为宜.培养时间太长，革兰阳性菌易染成白色.

（3）脱色是关头.脱色时间缺乏，菌细胞易染成阳性；脱色时间太长，菌细胞易染成阴性.

（4）可用已知革兰染色为阳性、阴性的菌种做染色的质量控制.

4.9.生化试验

.乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h，不雅察产酸（指示剂为酸性品红者为白色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）.

为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接中5%乳糖发酵管.绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性.或适当延长培养时间.

.靛基质试验（Ⅰ）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48小时，沿管壁参加靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰白色为阳性，呈试剂赋性为阴性.98％的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24小时便可出现阳性结果.常以无菌操纵先从管中取出1或2ml培养液进行查抄，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验.

.甲基红试验（M）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于培养液中参加甲基红指示液2～3数滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即不雅察，呈鲜白色或橘白色为阳性，呈黄色为阴性.

.乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于每2ml培养液中参加α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时（通常在30分钟）内出现白色判为阳性，无白色反响为阴性.

.枸橼酸盐利用试验（C）取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变成蓝色时为阳性，培养基颜色无改动，无菌苔生长为阴性.

4.10.结果判定

.当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性、靛基质阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，陈述1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，陈述1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌.

.MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为－＋――、革兰阴性埃希菌，陈述1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为＋＋――、革兰阴性埃希菌，陈述1g或1ml供试品检出大肠埃希菌.

.供试品培养物查抄不合适4.10.2中的任一项，陈述1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌.

.当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长但非大肠埃希菌，不克不及做出查验陈述.

4.11.注意事项

.MUG法不必从混杂菌中别离单个菌落.除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、埃希菌和芽孢菌，其MUG为阳性.因此，在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量，可排除革兰阳性菌的搅扰.至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即便有生长，本法能检出亦判为不合格.

.配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过，不然pH值偏高，MUG分化，自己则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光.

.培养时间供试品培养液接种于MUG培养基中，一般培养5h和24h要不雅察是否产生荧光，如荧光很微弱，不克不及准确判断时，可延长培养至48h再不雅察结果.由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反响的差别；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改动；大量竞争菌和样品自己物质成分的搅扰等，对结果的判断亦有影响.

.结果不雅察取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下不雅察，阳性对照管应有较强的蓝白色荧光，阴性对照管无荧光.供试品MUG管是否有荧光，应仔细不雅察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管.如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的不雅察时，亦可移去阳性对照管.

.药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响.在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变更，挑取可疑菌落往往凭经验，主不雅性较大，务必挑选2～3个菌落辨别做IMViC试验辨别，挑选菌落越多，检出阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落做IMViC试验辨别，则易漏检.

.在IMVIC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中.切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果.

.枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，按照试验资料，发明培养3天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性.仅培养2天不敷的，故试验培养时间改成2～4天.

.以IMViC试验来判断大肠埃希菌属中的大肠埃希菌是含糊的，有可能把埃希菌属的其他种判为大肠埃希菌.IMViC试验为＋＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活泼大肠埃希菌、弗格森埃希菌、赫尔曼埃希菌.IMViC试验为－＋――者，除大肠埃希菌外，还有非活泼大肠埃希菌、伤口埃希菌、蟑螂埃希菌.

.在各类供试品中检测大肠埃希菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验.检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保存一个月，备查.

生化试验也可采取商品化的自动阐发仪器进行、仪器可以给出菌种的判定结果，做相应陈述.