啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定概要.docx
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啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定概要
鬱MU工工誉女摩
浙江工业大学药学院
生物化学实验论文
2013年12月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文
摘要：
为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：
（1），蔗糖酶的提取与初提纯：
a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B;c、用乙醇沉淀离心得提取液C。
（2），蔗糖酶的纯化一QSepharose柱沉析法：
先装柱，再安装盐度梯度发生器
与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液Do
（3），蔗糖酶活力的测定：
第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的OD40值，得各提取液的酶活力与回收率。
（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：
遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD60值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍
数。
（5）,微量凯氏定氮法（以B为样品）：
先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCI滴定馏出液，计算蛋白质含量。
（6），SDS-PAG测定蛋白质的相对分子质量：
首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。
关键词：
蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS聚丙烯胺凝胶；标曲；电泳；
正文：
文献综述
蔗糖酶（Sucrase,EC321.2又称转化酶（Invertase），可作用于B21,2糖苷键,将蔗糖
水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。
蔗
糖酶的最适温度为45C-50C，最适ph为4.0-4.5.
实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理
酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。
酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。
经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。
1.2试剂与器材
1.2.1试剂
1啤酒酵母；
2醋酸钠（AR）;
3甲苯（AR）;
44mol/L醋酸；
595%乙醇（V-20C）;
60.5mol/LTris-HCIpH7.3缓冲液。
称取121.1gTris溶于1500ml的蒸馏水中，用4mol/LHCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml）,用蒸馏水稀释到2L,即为0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液。
70.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液：
将0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液稀释10倍即得。
注：
整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
1.2.2器材
1锥形瓶250ml（X1）,50ml（x1）；
2量筒10ml（X1）25ml（x1）;
3烧杯100ml（x1）,1000ml（x1）；
4具塞试管10ml（x3）；
5吸球、玻棒、滴管、pH试纸；
6培养箱；
7恒温水浴箱；
8磁力搅拌器，搅拌子；
9高速冷冻离心机。
1.3操作方法
1.酵母的自溶：
在弱碱中培养60小时；
2.初提取液A:
取出酵母自溶液体，经两次离心得初提液A；
3.热提取液B:
水浴提取液A,并使PH为4.5，离心得热提取液B
4.乙醇沉淀提取液C:
将B冷却并加入乙醇持续搅拌，不少于30min，离心得提取液C
1.4结果与分析
1.4.1结果
表2-1
提取液
颜色状态
体积（ml）
A
黄色液体
17.0
B
浅黄色液体
18.0
C
淡黄色液体
8.27
VA^=VA=17.0ml
Vb^=Vb-[VM（VA-3）]=18.0ml
Vc总=必•[Va/（Va-3）]•[Vb/（Vb-3）]=Vc•[Vb总/（VB-3）]=8.27ml
1.4.2分析
提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。
这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。
143结论
VC总=8.27ml。
VA总=17.0ml;VB总=218.0ml
1.5注意事项
1第一次离心后取液体时要小心；
2水浴时的温度不要超过50C。
同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。
冰浴时要迅速操作；
3冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失；
1.6认识与体会
实验操作无明显错误，操作仍能精确，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离心机；蔗糖酶在50°C以上失活。
2蔗糖酶的纯化QSepharose-柱层析法2.1实验原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。
由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。
当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子
（如Cl-）的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Ck浓度，含电荷
多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对
该物质进行定性和定量分析。
2.2试剂与器材
2.221试剂
10.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；
21mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；
30.5mol/LNaOH;
4QSepharose长期保存需置于20%乙醇中，4C保存。
注：
整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
2.2.2.2器材
1层析柱；
2梯度混合器；
3磁力搅拌器，搅拌子；
4紫外分光光度计；
5点滴板；
6尿糖试纸、擦镜纸；
7止水夹；
8烧杯、试管。
2.3操作方法
1•离子交换柱的填充：
将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少
量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。
2•缓冲液盐度梯度发生器的安装：
在低浓度一段装入搅拌子。
且要形
成梯度。
3.柱的平衡：
将柱子与恒流泵连通，用25mlTris-HCIpH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4.加样：
缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一
5.洗脱：
为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。
6.测0D值：
在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下：
表2-2
试管号
OD80值
试管号
ODbo值
1
0.322
14
0.120
2
0.447
15
0.109
3
0.060
16
0.083
4
0.054
17
0.077
5
0.065
18
0.069
6
0.031
19
0.126
7
0.028
20
0.305
8
0.016
21
0.900
9
0.037
22
1.014
10
0.048
23
0.673
11
0.061
24
0.281
12
0.231
25
130
13
0.284
7.酶活力测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取1、
2、5、12、13、14、20、21、22、23管进行测试。
酶活力测试方法：
在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。
将其合并成一管，VD=5.22ml
2.4结果与分析
2.4.1结果
Vd=5.22ml
VD总=VD•VC总/V样=5.6X6.1/0.5=86.34ml。
由数据得表如下：
蔗糖酶洗脱曲线图
1.2
1
0.6
0.4
0.2
0
试管号
系列1系列2
O
8
64
2O
1.^1.^1
度梯度浓盐
图2-1QSepharose柱层析法提纯酶数据处理表
2.4.2分析
1柱的高度与冲洗的流速、梅的浓度及柱的带电量大小会影响样品在柱
内的移动快慢；
2酶活力不是特别的强，也许是前面柱下端渗出液体导致蔗糖酶流失；
3适当增加柱的高度与降低冲洗液的流速能提高分离效率；
4在使用Q-Sepharose纯化方法之前还有过DEAE纤维素层析方法和
DEAESepharos层析方法，但比较这几种方法，用Q-Sepharose纯化方法有如下特点：
（1）提高实验效果。
琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高，
分离纯化蔗糖酶穿透峰小，分辨率高，回收率高。
蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离，提高纯度，真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上
的优越性，增强实验的意义。
（2）缩短实验时间。
梯度洗脱时间由原来的100min缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复，实验过程比较紧凑。
（3）节约实验支出。
离子交换介质DEAE纤维素由于流速慢，柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变，不能承受0.1M以上NaOH清洗連生效果差，寿命短。
琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。
且其化学稳定性极高，不易破碎，可以承受IMNaOH的清洗，重生效果好，可以使用数百至上千次，因而降低了成本。
243结论
Vd5.22ml
VD总=86.34ml。
2.5注意事项
1在整个柱操作过程中，要严格防止液面低于交换剂的表面。
当液面低于交换剂表面时，空气进入交换剂内，形成气泡，而影响分离效果；
2加样不可太快，以免搅浑交换剂的表面，而使分离不纯；
3恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液体滴下来，同时防止液体下滴过快而引起干柱。
是绝对不能干柱；
4盐度梯度发生器内气泡要除尽；
2.6认识与体会
在本实验中，由于操作失误，导致柱内气压太大，加样时在柱的下端有液体流出，影响了本实验的准确性，使得D的酶浓度不高，影响后续实验，提纯也不好。
3蔗糖酶活力的测定
3.1实验原理
本实验用DNS法测还原糖的含量，进而计算酶的活力。
蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖，可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应，生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。
在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系，于是做出葡萄糖标准曲线以后，就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。
酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力，通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。
酶活力单位数（U）:
在一定条件下，3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量，称为1个活力单位数。
总活力单位数=（V测体积测出的葡萄糖克数/V测）*（试管溶液总体积/2）*V总*n
V总为各种提取液在提取过程中的总体积。
酶回收率=（各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活）*100%
3.2试剂与器材
3.2.1试剂
13,5-二硝基水杨酸
（1）甲液：
溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
（2）乙液：
称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7~10天后使用。
2葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml）准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先在105C干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。
5%蔗糖、
30.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml的1mol/L醋酸调pH到4.6,稀释至2L;
5沁糖用0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液配置；
2mol/LNaOH溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。
3.2.2器材
1电炉；
2恒温水浴；
3紫外分光光度计；
4试管、吸管；
33操作方法
1•葡萄糖标准曲线的制作
取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。
将各管内液体混合均匀，在沸水浴加热5min。
取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，ODfi为纵坐标，画出标准曲线。
表2-3葡萄糖标准曲线的制作
试管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖
0
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
蒸馏水
3.00
2.20
2.00
1.80
1.60
1.40
DNS
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
总体积
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
OD
0.000
0.234
0.406
0.557
0.746
0.914
2•酶活力测定
1将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：
初提取液（1:
200）；热提取液B（1:
200）；乙醇提取液C（1:
200）；柱分离液D（1:
20）。
2取8支试管，按表3-2加入各种试剂。
表2-4酶的催化反应
项目
A（1:
200）
B（1:
200）
C（1:
200）
D（1:
20）
加样
A对
A样
B对
B样
C对
C样
D对
D样
酶液/ml
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2NNaOH
0.50
——
0.50
——
0.50
——
0.50
——
35r预热10min,同时预热5%蔗糖
5淞糖
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
2.00
立即摇匀，准确计时，反应3min
2NNaOH
——
0.50
——
0.5
——
0.50
——
0.50
总体积/ml
4.50
4.50
4.50
4.5
4.50
4.50
4.50
4.50
③取反应液A0.15ml，B0.25ml，C0.10ml，D0.90ml进行DNS反应,
测定540nm处ODfio
得到OD=0.348ODb=0.288ODc=0.45606=0.508
3.4结果与分析
3.4.1结果
1绘制葡萄糖标准曲线
OD54值
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.914
y=4.25x-0.4486
0.050.10.150.20.250.30.35
葡萄糖含量/mg
葡萄糖标准曲线图
图2-2
总活力单位数=mg/V测・4.5/2•V总・n
酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活）•100%
本次试验最终结果：
表2-5
项目
初提液A
热提取液B
乙醇提取液C
柱分离液D
V测/ml
0.15
0.25
0.10
0.90
mg
0.187
0.173
0.213
0.225
V总/ml
17.1
19.4
9.0
97.8
总活力单位数/U
9613.62
6051.64
8618.40
1100.25
回收率/%
100
62.95
89.65
11.44
3.4.2分析
（1）、理论中A、B、C、D的回收率应该是越来越低的，但这里确实C>B,可能是因为C中蔗糖酶浓度高于B或反应时间控制不好；
（2）、蔗糖酶标曲在01.-0.7之间呈线性关系，低于01或高出0.7都要重新做过；.
1做葡萄糖标准曲线时，加完各种试剂后要充分摇匀。
要求测得的OD
值在0.1~0.7
2测定酶活力时，要准确反应3min，这个反应时间应该精确把握，不要多1秒也不要少1秒
3测得在线性范围外的0D值，需重新配液显色反应。
4由于某些原因我们这一组用的是另一组的试剂，所以数据不符合前面的实验；
3.6认识与体会
（1）、还原糖的测定方法有菲林试剂热滴法、3,5-二硝基水杨酸法、nelson试剂法；
（2）、在这种定量且精确地实验中要严格控制一些因素，比如在这个实验中必须严格控制反应时间；
4蔗糖酶的蛋白质含量测定及比活力计算
4.1实验原理
比活力是指单位质量（mg）蛋白质中酶的含量（U），常用来表示酶的纯度。
比活力=酶的含量（U）/蛋白质含量（mg）
测定蛋白质含量的方法有福林-酚试剂法、微量凯式定氮法、紫外吸收法、考马斯亮法等，本实验采用的是福林-酚试剂法，或称Lowry法，蛋白质与Folin-酚A试剂（碱性）在碱性条件下形成铜-蛋白质复合物，然后加入Folin-酚B（酸性），铜-蛋白质复合物将其还原形成深蓝色钼蓝和钨蓝化合物。
因为Folin-酚B
中的磷钼酸-磷钨酸可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝色化合物。
蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在750nm和660nm有较强的吸
光值。
故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的OD值，然后据此测出未
知样品的蛋白质浓度⑸。
4.2试剂与器材
4.2.1试剂
1试剂A（碱性铜试剂）取Na^CQ（AR）10g和NaOH（AR）2g，加蒸馏水
30ml，微热溶解：
另取酒石酸钠（N&C2H3O3?
2H2O,AR）0.1g和CuSQ?
5H2O
（AR）0.05g，再加入30ml蒸馏水微热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用
水稀释至100ml，即为试剂A。
该试剂为含10%NqCQ0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/LNaOH溶液。
保存于塑料试剂瓶中，24C至少可使用1个月。
溶解于500毫升蒸馏水中。
；
2试剂（酚试剂）在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4?
2H2O）,25
克钼酸钠（Na2MoO4?
2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加
入150克硫酸锂（L2SQ）,50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标
准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。
3标准浓度牛血清白蛋白溶液（200卩g/ml）精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。
牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaC溶液。
；422器材
1分光光度计（使用直径为10nm的比色皿）；
2刻度吸管0.5ml（X1）,2ml（x1）,5ml（x1）
3试管1.5cmX15cm（x8）;
4具塞试管10ml（x3）;
5恒温水浴箱（55C）;
4.3操作方法
1•标准曲线的制作
表2-6标准曲线的配置加样表
管号
0
1
2
3
4
5
BSA
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
水
4.5
4.3
4.1
3.9
3.7
3.5
试剂A
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
静置10min（立即充分混匀）
试剂B
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
静置10min（立即充分混匀）
试剂B
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.237
0.216
混匀55T水域5min,测A660
OD6o
0.000
0.344
0.4810.623
0.739
由于在振荡时，管1有洒出，因此做了两次
2.未知蛋白浓度的测定
按A（1:
100）、B（1:
100）、C（1:
20）、D（不稀释）进行稀释，
A稀释液去0.4ml，B、C、D稀释液各取5ml测定OD6°（所得数据如上表所示）＜【注意】Folin-酚B试剂在酸性条件下稳定，而Folin-酚A试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。
当Folin-酚B试剂加入后,应迅速摇匀（加一管，摇一管），使还原反应产生在试剂被破坏之前。
4.4结果与分析
4.4.1结果
表2-7实验结果数据记录表
0.8
160
0.623
1
200
0.739
样品
A1
B1
C1
D1
OD66o
0.390
0.276
0.347
0.118（小）
表2-8实验处理结果总汇表
总体积
/ml
总酶活/u
总蛋
白/mg
比活力
/u/mg
蛋白回
收率/%
酶活回收率/%
纯化倍数/倍
初提取液A
17.0
9613.62
316.20
30.40
100
100
1.00
热提取
液B
18.0
6051.64
210.24
28.78
66.49
62.95
0.95
乙醇提取液C
8.27
8618.40
16.53
521.38
5.23
89.65
17.15
柱分离
液D
86.34
1100.25
0.37
3014.36
0.12
11.44
99.16
（1）、此次方法的优点是操作简单，灵敏度高；缺点是蛋白质浓度和光密度
线性关系不够严格，而且不同的蛋白质会因Tyr和Trp的含量不同，造
成显色程度有差异；
（2）、此实验中由于蔗糖酶不断提纯，虽然也不断损失，但比活力还是应该上升的，但这次实验中比活力A>B是因为上次实验我们组的酶活力没测，这次用的是上次做的那个组的酶活力；
（3）、测D的0D值时是0.118，不在线性范围内，但由于D试剂不够用，不重做，本来应该将D的取样量提高重做；
4.5注意
1试剂A加完后，立即充分混匀，静置10min。
再向各管加B后放置10min，再加第二次。
2每次加A、B后应立即迅速充分混合。
4.6认识与体会
（1）、folin-酚法之所以比双缩尿试剂法灵敏是因为此法显色原理与后者相
同，只是加入了第二种试剂----folin-酚B试剂，以此增加显色量，从而提高了灵敏度；
（2）、做实验时要谨慎仔细，尽量避免不必要误差，在本实验中，我在振荡试管时有时会将溶液振出，虽然量不多，但由于此法灵敏度高也会造成相当的误差，在
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