原位杂交手册.docx
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原位杂交手册
第1章共用程序
引言：
本章介绍了本实验最大体的实验程序，包括中期染色体制片；质粒的转化与DNA的提取；探针标记检测和基因组总DNA的提取
第1节原生质体染色体制片
试剂：
饱和a-溴萘、、固定液（新鲜3：
1甲醇冰乙酸）、酶解液（20%纤维+2%果胶酶）、INHCl、95%酒精
实验步骤：
浸种室温下浸种约一天（也可1-2h）
发芽培育皿中垫湿滤纸三层，利子分散其上，间留距离，勿堆积，种子上层覆盖一层水浸湿的滤纸，25-30℃下发芽，天天水洗一两次，约2-3天可取根。
NOTE：
换水是很重要的，水不能过量，以不留流动水为宜，水分过量易长芽而根长不好。
预处置
方式1：
根长至-2cm长时切取1.5mm左右的根尖，饱和a-溴萘约25℃处置2-3小时，水稻一般不预处置。
方式2：
根长好后将种子置于4℃冰箱处置一个晚上，第二天在25℃下恢复2-3h，也可取得许多分裂相。
NOTE：
何进取根尖最好具随机性，与季节和细胞割裂时期很有关系。
（玉米8:
00AM，水稻11:
00-12:
00AM）
水洗反复几回
前低渗ddH2O或0.075MKCl（溶于100mlddH2O）低渗30min（室温）。
固定新鲜3∶1甲醇冰乙酸固定2-3小时或4℃留宿。
NOTE：
必然要用新鲜固定液；若是用于石蜡切片组化显色，甲醇固定的材料会致使很高背景，应换用4%多聚甲醛。
水洗反复几回，洗净。
酶解2%纤维素酶+2%果胶酶混合（1∶1），28℃下处置3小时左右。
NOTE：
酶解是最相当重要的一步，第一是酶的质量，很多酶都可致使割裂相少，以SERVA公司的果胶酶为最好，按照材料不同，酶解时刻会有所转变。
洗载片载片必然要干净，以防材料脱落和维持清洁的背景。
洗片步骤：
1）INHCl中3min以上
2）自来水洗（每片单独漂洗）接着用双蒸水洗
3）95%酒精浸泡30min以上（每片单独放入）
制片小心吸去酶液，水洗几回，吸取1-2个根尖于干净的干载玻片上，滴半滴固定液，用镊子敲至浆状，滴2-3滴固定液使材料分散，火烤至着火。
NOTE：
敲得越碎越好，敲至固定液干后，再滴固定液，迅速涂开，火焰干燥，干燥后肉眼观察应为规则干净的小雨点状，若小雨点上像有一层不透明的薄层，说明酶解时刻不够。
镜检检后将符合要求的制片贮存于-20℃下备用。
NOTE：
每张制片上至少应有150个左右分散良好但背景干净的割裂相方可用于杂交。
REFERENCES
第2节质粒的转化与扩增
若寄来的探针是插在质粒中cDNA克隆或基因片段，第一要对其进行转化，一般利用作为载体，转化的关键在于如何制备感受态的细胞，本实验利用CaCl2来制备感受态细胞，此方式简便、快速。
试剂：
LB培育基，0.1MCacl2，70%甘油
实验步骤：
感受态的制备
从-20℃下取2-5µl，涂在平板上，37℃培育16-20h。
挑取单个菌落于20ml已预热至37℃的LB培育基（不含Amp）中，37℃，300rpm猛烈振摇约3h。
培育物转移至4支预冷的5mlEppendorf管,冰上放10min，4000rpm离心3-5min，回收细胞（4℃）；倒出培育液，倒置lmin。
以5ml预冷的0.1MCacl2重悬每份沉淀，冰浴30min。
4000rpm离心5min（4℃）；倒出培育液，倒置lmin。
每管加预冷的，重悬细胞，冰浴lh
每管100µl分装,保留于-20℃下,长期保留转化效率会有所下降。
质粒DNA的转化
取-20℃保留的感受态细胞二支，冰上溶解10min，一支加质粒cDNA（<10µl，<30ng），混匀，另一支作为对照，冰浴30min。
42℃水浴放置90秒，维持1-2min。
快速置于冰浴，维持1-2min。
每管加200-300µl培育基，用水浴加热至37℃。
37℃摇床温育45min。
扩增（无菌操作）
将温育后的转化细胞转移至含抗生素（100µg/mlLB）的LB平板上。
当液体被培育其吸收后，倒置平板，37℃培育12-16h，时刻不宜太长。
菌落生成后，挑取单个菌落，37℃于LB液体培育基中培育24h左右。
加70%甘油，-20℃保留。
第3节质粒DNA的提取
试剂：
LB固体培育基，LB培育基，Sol.Ⅰ，Sol.Ⅱ（当配当用），Sol.Ⅲ，，异丙醇，70%酒精，RNaseA，100%EtOH，TE溶液
实验步骤：
活化含重组质粒细菌用划线法接种在LB固体培育基上，37℃培育箱培育留宿。
扩增挑选单个菌落接种在含20µlAmp的20mlLB培育基中，摇床，250rpm，37℃培育16-18小时，至溶液混浊，但不能培育太久。
离心两支5mlEppendorf分装一半，8,000rpm（太高速度的离心会致使沉淀物难以悬浮Sol.Ⅰ）离心10-15min，去上清液，再倒入另一半，从头离心，去上清，沉淀归并。
裂解
Sol.Ⅰ，200µl，振荡混匀。
（确使细菌沉淀完全分散）
Sol.Ⅱ，300µl，（当配当用）振荡5秒钟，然后冰上10min。
（快速倒置离心管5次，以混合管内容物）
Sol.Ⅲ，400µl，振荡5秒钟，置冰上10-15min以上。
（盖紧管口，将管倒置后温和振荡10秒，冰上3-5分钟）
离心13,000rpm离心10min，上清液转入Eppendorf管中。
抽提加入等体积，至乳浊状，10,000离心5min。
沉淀吸上层水相至新的Eppendorf管中，加等体积异丙醇（或无水乙醇两倍体积），振荡30秒钟，然后置于-20℃下沉淀DNA，至少2h。
收集12,000rpm离心10min后，去上清液，37℃干燥。
洗涤加70%酒精洗涤2-5min，12,000rpm离心10min，同上干燥。
NOTE：
用于DNA原位杂交的探针，从此步骤直接进入最后一步（溶解保留），但用于RNA原位杂交的探针，必需还经后续RNaseA处置及抽提步骤。
溶解加入50µlddH2O溶解，在4℃下溶解30-60min。
RNaseA处置加入10mg/ml，37℃处置1h。
抽提再加入50ulddH2O，加入100ul混匀，10,000离心5min。
沉淀吸上层水相至新的Eppendorf管中，加2×体积100%EtOH沉淀留宿。
收集12,000rpm离心10min后，去上清液，37℃干燥。
保存加入20µlTE溶液，在4℃下溶解30-60min（一般20ulTE溶解5ml菌液提取的质粒最终探针浓度约为ul，不计载体），然后转入-20℃冰箱保留，或用75℃水浴15min后转入-20℃冰箱保留。
NOTE：
为了使双色FISH必然体积杂交液中探针浓度达必然值，此处控针浓度不能过小。
酶切反映体系
质粒DNA1ug（约3-4u1）
ddH2O至终体积15ul
10×Buffer
Enzyme
混匀，适当温度下（一般为37℃）反映45~60min
电泳鉴定1~2%的琼脂糖电泳鉴定，每条泳道两条带说明酶切完全。
碱变性提取质粒用的配制
100ml（灭菌10磅15min.4℃保留）
成份
用量
终浓度
分析纯葡萄糖（glucose）
1.0M
0.5M
ddH2O
0.9g
2.5m1
至100ml
50mM
25mM
10mM
包括a,b两种，历时掺合
成份
掺合比
工作浓度
10%SDS
SDS
4g
100ul
1%
ddH2O
约35ml
稀碱调（变化快）
ddH2O
至40ml
10MNaOH
NaOH
40g
20ul
0.2M
ddH2O
至100ml
ddH2O
880ul
（3MKAc）100ml
KAc25.2g
H2O80ml
冰乙酸（约）
H2O 至100ml
（灭菌，4℃保留）
NOTE：
［K＋］为3M，[Ac]为5M
平衡酚:
氯仿:
异戊醇=25:
24:
1（可改成氯仿:
异戊醇=24:
1）
附：
平衡酚步骤：
重蒸酚在68℃左右溶解后，加入等体积0.1M（含%β-巯基乙醇），激烈振荡，加入固体Trisbase调pH。
待分层后，测得上层水相pH在以上（可在加入1g/100ml左右Tris后，pH仍在以下时去水相，再加1MTris反复萃取直至水相pH至以上）。
搜集基层有机相于量筒，迅速测定体积后，再迅速转移至棕色瓶中，并覆以1/10体积的0.1MTris-Cl（含%β-巯基乙醇）。
第4节探针标记
大体知识
标记应考虑的老是主要有两点：
标记物和标记方式。
一般原位杂交中标记物都是用非放射性标记，而Southern杂次顶用放射性标记，非放射性标记的标记稀常见珀有三种，Fluorescein-dUTP,Bio-dUTP和DIG-dUTP,Fluorescein-dUTP标记称直接标记，快速、简便、背景低、但灵敏度不高，适于检测重复序列。
后二者标记称间接标记，能够在杂交后对信号进行级联放大，适于检测单/低拷贝序列。
标记方式主要有四种：
DNaseⅠ/DNAPolymeraseⅠ介导的切口平移法（NickTranslation）；Klenow介导的随机引物法；结尾转移酶（TdT）介导的结尾标记法和Taq酶介导的PCR法，对于>lkb的探针，建议采用切口平移法；随机引物法标记效率比切口平移高，更适合于100bp-lkb探针的标记；而对于<100bp的探针，则需要用结尾标记法；但如果是你手头的探针量很少（少至50ng），相应引物的话，PCR是最佳选择，简便快速，可制备大至4kb的探针。
实验步骤
切口平移标记法（Biotin）
本实验室用于中期染色体原杂交的探针一般用生物标记。
依次加入下列试剂于Eppendorf管中：
探针数
1
2
3
终浓度（50ul中）
dNTP
10
20
30
30uMofeach
10×Buff
5
10
15
1×
Bio-11-dUTP
4
8
12
30uM
ddH2O
26
52
78
DNaseⅠul）
5
DNAPol.Ⅰ
12U
24U
36U
12U
质粒DNA（~ul）取上述混合液45ul，加相应探针5ul
～2ug
15℃下反映h,加5ul终止液（Stopsolution）终止。
NOTE
DNAPol.Ⅰ的量应参照各厂家提供的浓度，以每50ul标记液中含12U为准。
原位杂交探针的适合长度为300～600bp，照此系统标记中DNaseⅠ用量，一般可达到这一目的；若为NT试剂盒，其提供的浓度应已考虑这一参数，因此酶量应已优化。
此刻标记一般用华丽公司试剂盒[包括10×Buffer、消毒三蒸水、dNTP、stopsolution（0.5MEDTA）]。
纯化已标记的探针：
制作柱子
在管底部用青霉素皮试探头刺孔，将少量硅化玻璃丝加在底部，套入去底的管中，再置于15ml培育管中，加入750µlSepharoseCL-6B于穿孔管中，25,00rpm离心5mim。
用另一新管改换，贴上Prode标签。
在作好的新鲜柱子上，当即加入已标记的Probe（注意柱子必然要看成当用），25,00离心10mim。
测定纯化后Probe的体积，贮存于-20℃下备用。
其它探针标记方式：
用于多色FISH或Fiver-FISH，除用生物素标记外，至少还要用到另一种标记物，一般也为地高辛（Digoxigenin/Digoxin，DIG）；而用于SouthernBlotting时，则一般用同位素（Isotope）标记，也可用DIG标记。
介绍两种试剂盒的标记方式（试剂盒上有）
DNaseⅠ/DNAPolⅠ介导的切口平移标记
法（32P）（NickTranslationLabelingKit，Promega）
Klenow介导的随机引物标记法（DIG）
（DIGLabelingandDetectionKit，.）
反应体系（50ul）
反应体系（50ul）
dNTP（dATP,dTTP,dGTP）
10×Buff
回收的Probe（不含载体）
ddH2O
DNaseⅠ/DNAPolⅠ
32P-dCTP（最后加）
10ul
5ul
5ul（约1ug）
21ul
5ul
4ul
dNTP（dATP,dTTP,dGTP）
10×Buff
回收的Probe（不含载体）
6merPrimers（ul）
ddH2O
DNaseⅠ/DNAPolⅠ
32P-dCTP（最后加）
10ul
5ul
5ul（约1ug）
3ul
21ul
5ul
2ul（5U）
15℃下反应h,Stopsolution终止
37℃下反应h,Stopsolution终止
NOTE
应用于SouthernBlotting的探针应为不含质粒载体的插入片段，因此应先用相应的限制性酶进行酶切，而后用低熔点琼脂糖对探针进行回收。
相较之下，PCR标记的长处是只须极少量（50ng）的插入片段（模板）即可扩增出大量高效标记的探针（Friedman,1990），而且一般直接可用少量细菌裂解液做模板。
缺点是必需要有目的插入片段的特异性引物和相应的仪器设备，而且，人们老是发觉一些克隆，它们不能用这种方式扩增，原因不明。
探针标记用溶液配制
20×生物素稀释液10ml
成分
用量
工作浓度
1M
0.5MEDTA
ddH2O
1ml
2ul
9ml
5mM
5uM
NOTE:
每管1ml分装，-20℃保留。
使历时稀释20倍。
Bio-11-dUTP购进时一般为贮存浓度10mM（若是为固体，则溶于稀
释液中）。
分装成1ul/管贮存，历时每管加入19ul稀释液稀释成工作浓度0.5mM。
稀释后的Bio-11-dUTP不适合长期保留，反复冻溶5次后将影响标记效果。
DNaseⅠ稀释液=10×SA-HRP稀释液
DNaseⅠ贮存液（1mg/ml）10ml
成分
用量
贮存液中浓度
1M
甘油
1MMgCl2
ddH2O
DNaseⅠ
200ul
10ul
20mM
50%
10mM
1mg/ml
NOTE：
此贮存液要先用DNaseⅠ稀释液按以下方式稀释。
DNaseⅠ稀释贮存液（ul）
取1mg/mlDNaseⅠ贮存液2ul，加入198ulddH2O，振荡混匀，取混匀后的液体3ul，加入7ulDNaseⅠ稀释液，振荡混匀；再取混匀后的液体5ul，加入15ulDNaseⅠ稀释液，振荡混匀，每管分装，-20℃保留。
第5节点印渍检测标记效果（NBT/BCIP显色程序）
大体知识
检测和定位抗原一般是通过抗原-抗体反映完成。
在通用的二级抗体上连接荧光分子或酶，即可进行荧光装置直接检测或经酶底物显色后间接检测。
后者称酶联免疫显色反映（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssayELISA），在许多领域都占有重要应用。
常常利用的酶是辣根过氧化物酶horseradishperoxidase（HRP），常通过底物DAB来显色；另一种是碱性磷酸酶alkalinephosphatase（AP），通过底物NBT/BCIP来显色（Ruzen，1995）（如下图）
应用
①检测探针标记效果；②检测ISH信号；③基因表达原位分析（切片上的mRNA定位；蛋白质定位）；④检测细胞凋亡中DNA特异片段化；⑤DIG或Biotin标记的SouthernBlotting，WesternBlotting；⑥ELISA
实验步骤：
生物素标记的探针
DIG标记的探针（详见KIT，.）
点膜
1ulProbe点于2cm×3cm硝酸纤维上，同时点对照
烤膜
80℃下20min
封阻
55-60℃下在小培养皿BufferⅡ中用摇床摇30min（60℃以上BSA会变性）
洗膜
BufferⅠ洗膜2min（5mlEppendorf管）
偶联
偶联SA-AP溶液5ml（SA-AP，BufⅠ5ml），37℃摇床，30min（黑色5mldorf管）
0.05M中以1∶5000稀释抗DIG-AP.）,并以此代替SA-AP溶液。
洗膜
BufferⅠ2min，BufferⅢ2min（5mlEppendorf管）
显色
加显色液（NBT/BCIP），20℃（或37℃）下10min（黑色5mldorf管）
烘膜
80℃10min，然后贴在记录本上
第6节CTAB法提取植物总DNA
第2章中期染色体原位杂交
引言
通过原位杂交（insituhybridizationISH）对特异DNA序列在植物染色体上进行物理定位，此刻在植物分子生物学的许多领域变得日趋重要。
ISH能够给人们提供基因或DNA序列在染色体上的真实物理位置和顺序信息（Heslop-Harrison，1992；Leitch，1994；Bennett，1995）。
有助于通过染色体步查分离目的基因的研究，也可令人们对物理图谱和遗传图谱进行比较（Gustafson，1990；Pedersen，1995），架起了二者之间的一座桥梁（deJong，1999）ISH在方式上也慢慢形成了从繁琐到简单、从放射性标记到非放射性标记、从DAB检测向荧光（FISH）再向多色荧光检测、从常规杂交向原位PCR和Fiber-FISH的进展格局，灵敏度和分辨率正在由Mb向kb、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAC/YAC的方向迈进。
DNA原位杂交的载体有以下几种：
间期（interphase）染色质；减数割裂粗线期（pachytene）染色体；中期（metaphase）染色体；DNA纤维（DNAFiber）。
应用
基因定位
分析DNA序列位置与基因组高级结构、基因活性及遗传重组之间的关系
转基因植物的肯定、鉴定基因插入位点
鉴定外源渗入染色体片段（GISH）
基因克隆（Fiber-FISH）
物种间的亲缘关系
多倍体形成研究
第1节原位杂交
NOTES
本章介绍的是生物素标记探针的原位杂交程序
整个操作中，除非特别指明，应注意维持载玻片湿润
除非特别指明，均应在20-25下操作。
一、所需试剂及仪器：
水浴锅、温箱、烘箱；
70％、95％、100％EtOH，去离子甲酰胺，2×SSC，20×SSC，RnaseA，SDS（10%），Probe。
二、实验步骤：
简单描述为：
制片干燥RNaseA处置变性脱水探针变性杂交
一、设置37℃，70℃水浴锅，37℃温箱，60℃烘箱
梯度乙醇脱水染缸（各50ml）：
染缸1：
70%EtOH
染缸2：
95%EtOH（保留在-20℃下）
染缸3：
100%EtOH
二、干燥：
在60℃烘箱中烤一小时或在室温下干燥。
前者有助于染色体在载玻片上固定，更难脱落。
但就是在空气中干燥，染色体一般也不会脱落。
3、预备变性染缸：
染缸4：
35ml去离子甲酰胺（不灭菌）在70℃水浴中保温
染缸5：
15ml2×SSC，加盖
Note：
现在不能把两种溶液混在一路预热，染色缸随水浴锅一路升温，不然易引发染色缸破裂
4、预备RNaseA溶液（1µg/ml）染缸：
染缸6：
原液5µl（10mg/ml）37℃水浴保温
2×SSC50ml（灭菌）
五、RNaseA处置，37℃一小时。
Note：
也可直接吸取RNaseA溶液50µl左右，用干净盖玻片盖好，保温皿内37℃保温1h。
六、敲一盒冰，掏出-20℃下配制杂交液的药品，冻融后配制杂交液
片子数（不同探针）
123456
终浓度
FAD（Sigma）（100%）
硫酸葡聚糖（50%）
20×SSC
SDS（10%）
sssDNA（华美，10mg/ml）
50%
10%
2×SSC
%
%
Probe
每张片子取混匀溶液43µl，加相应probe7µl
（30-40ng/µl，计载体），混匀，短暂离心，置于冰上
～5ng/µl（不计载体）
NOTES:
所有药品应始终放在冰上
配制好的杂交混和液可在-20℃下保留6个月
SDS是一种湿润剂，可帮忙探针穿透进入，利用浓度一般为～％
7、配制70％FAD：
在RnaseA处置完成前，将在70℃下的去离子甲酰胺加入热的2×SSC中继续保温。
（70µlFAD＋30µl2×SSC/片，70℃烘箱）
八、变性：
RNaseA处置完后，片子在70℃70％FAD中处置min。
九、脱水（-20℃）：
掏出后当即放入
-20℃70％乙醇-20℃，95％乙醇，-20℃，100％乙醇，
中，5min5min5min
10、制片掏出后，空气中干燥20min以上，直至表面完全不留水珠。
NOTE：
最好在脱水后检查一下染色体形态，若是已经变形，就没必要再往下做了。
1一、杂交液变性：
在用冷无水酒精处置的同时，将配好的杂交液在滚水中煮10min，掏出后当即置于冰上，不可怠慢，在冰上至少维持5min，方可杂交。
1二、制作保湿皿：
大培育皿底部放三层滤纸，加2×SSC湿润，直至可看到少量能够流动的溶液，上面加两根玻棒，以支持制片，避免与2×SSC接触。
13、杂交：
玻片干燥后，杂交液在冰上已放置10min以上，这时就可以够将制片放入保湿皿中，在冰上用枪头搅匀杂交液，接着将杂交液等量（约40µl）加入制片，使杂交液成一大滴，滴在片子淡红中间，盖上盖片，如有气泡用枪头轻轻赶出，盖上保湿皿，在90℃烘箱中保温10min，转入37℃温箱，用封口膜封好保湿皿，保湿10-21小时。
第2节用DAB检测杂交信号
小序
目前用ISH能够很容易定位重复序列，当有关单/低拷贝在植物中的定位报导很少，这是由植物材料本身存在的一些问题造成的。
但如果是对信号进行放大，并对某些操作步骤特别注意的话，仍是能够检测单/低拷贝序列的，专门是冷凝电荷耦合（CCD）照相装置的应用，有可能抓取肉眼看不到的信号，可将灵敏度提高30倍（Wiegant,1991）。
目前植物中中期染色体原位杂交检测灵敏度在10kb左右。
大体知识
间接标记的益处就是可利用级联免疫放大系统对信号进行放大。
对于生物素标记的探针，其中还能够掺入链霉抗生素（链抗，SA）－生物素系统，比一般抗原－抗体系统更灵敏，因为生物素与抗生物素蛋白（SA）有更强的亲和力。
检测原理如下图简示（参考探针标记检测）：
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