分子生物学实验讲义.docx
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分子生物学实验讲义
实验一植物基因组DNA的分离
一、相关知识
分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。
不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。
例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。
一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：
（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；
（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。
如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。
二、实验原理
植物DNA的提取程序应包括以下几项：
首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。
分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。
其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。
去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。
通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。
最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。
剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。
分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。
因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。
大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。
但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。
三、实验方法
1．向10mL离心管中加入5mL的2×CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），60℃保存预热，预热后加入10μL0.2%的巯基乙醇,巯基乙醇的作用为抗氧化剂。
2．用液氮将研棒、研钵预冷，将0.5-1.5g叶片放入研钵，捣碎成粉末，转移到①中的离心管中，轻轻转动离心管，使植物组织在提取缓冲中均匀分离,置于60℃水浴摇床中保温30min。
3．加入等量5mL氯仿，于空气摇床中摇15min，使管内混合物成乳浊液，此时蛋白质充分接触氯仿与核酸分开，室温4000rpm离心15min分相，含蛋白质胞碎片的有机相位于管的下面，上层为含核酸的水相。
4．离心后，用去头的Tip（怕破坏DNA长链）将上清液转移到新的离心管中，将2/3量即3.3mL预冷的异丙醇与之缓慢混匀，20℃，8000rpm离心10mim，沉淀DNA。
5．移去上清液，干燥后（用无菌操作台通风干燥）加1mLTE溶解沉淀。
6．加入5μLRNase（10mg/mL）37℃保温45min，以去除DNA中的RNA。
7．加入等量（1mL）苯酚—氯仿—异戊醇（25:
24:
1）,室温空气摇床缓缓混匀10min,室温下4000rpm离心10min，进一步去除蛋白质,用去头的200μLTip将上清转移到一支新的离心管中。
8．加入1/2量（0.5mL）苯酚—氯仿—异戊醇（25:
24:
1）,摇床缓慢混匀10min，4000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中。
9．加入等量（0.8-1mL）氯仿，摇床摇匀10min，4000rpm离心10min，将上清液移到新管中,这一步可除去水相中残留的酚。
10．加入1/10量（0.1mL）3MNaAc，2.5倍量（2.5mL）冷乙醇，缓慢混匀，DNA沉淀析出，4000rpm离心10min。
11．弃去上清，干燥30-60min，加入0.5-1mLTE，4℃溶解并保存。
四、实验要点
1．CTAB溶液在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加入冷冻的植物材料中之前必须预热。
2．在最适条件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纤维状，很容易一下子就从溶液中钩出。
不过，某些植物种的DNA沉淀中可能含有杂质，特别是多糖，使DNA沉淀呈絮状或胶状，这种情况下可能需要稍事离心才能得到DNA—CTAB沉淀。
3．饱和酚虽然可有效地使蛋白质变性,但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚可以溶解含poLy（A）的mRNA。
如果用苯酚和氯仿的混合液，可减轻这两种现象，同时可加入适量的异戊醇（苯酚—氯仿—异戊醇=25:
24:
1），异戊醇的作用是消泡，并使蛋白质层紧密，使水相和有机相分层较好。
五、所需仪器、耗材
六、所需试剂
1．CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）
2．巯基乙醇
3．液氮
4．氯仿
5．冷异丙醇
6．TE缓冲液
7．RNase
8．苯酚—氯仿—异戊醇（25:
24:
1）
9．3MNaAC
10．冷乙醇
七、试剂配制
1．1MTris—HCl，pH=8.0
2．0.5MEDTANa2·2H2O，pH=8.0
3．2×CTAB
4．TE缓冲液
5．3MNaAC（pH=5.2）
6．0.2%巯基乙醇
7．20×SSC
8．10mg/mLRNaseA
八、思考题
1．提取缓冲液中CTAB或EDTA的作用是什么？
2．怎样去除DNA杂质中的蛋白质和RNA？
3．纯化DNA步骤中，苯酚、氯仿、异戊醇各有什么作用？
为何交替使用？
实验二RNA的分离
一、RNA和无RNA酶的环境
在植物细胞中存在不同类型的RNA。
rRNA占总RNA的70%;tRNA在细胞中的含量也较丰富（15%），mRNA含量为细胞总RNA的1-5%,大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多聚A（PolyA）尾巴。
在进行RNA操作时，需要特别注意RNA被RNA酶降解。
由于RNA酶存在于所有的生物中，并且RNA酶是一种耐受性很强的酶，传统的高温灭菌的方法不能使之失活。
RNA酶的污染既可能源自内部，在植物的某些组织如根中RNA酶含量特别高，也可能源自外部，如玻璃器皿，缓冲液和操作者的皮肤。
其中人的皮肤表面有大量的RNA酶。
所以应尽可能在无RNA酶的环境下进行有关RNA操作,具体措施如下：
1．分离RNA以前，将所用玻璃制品及取样剪刀、镊子等置于烤箱在300℃下烧烤4h或180℃烘烤8h以灭菌。
2．应用焦碳酸二乙酯处理过的水（DEPC-SDW）进行溶液的配制，并高压灭菌20min。
DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。
DEPC-SDW配制如下：
100mL水中加入0.2mLDEPC原液，放于摇床上充分混匀并在室温下作用数小时，然后高压灭菌15min。
3．所用的Tip、离心管、PCR管等塑料制品都用0.05%DEPC-H2O处理：
灌满DEPC-H2O，37℃放置2小时，用DEPC-SDW冲洗，并于100℃干烤15分钟并高压灭菌15分钟。
4．人的汗液中含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换，通常使用的实验室设备诸如移液吸管等应浸泡于酒精中，使用前晾干。
二、实验原理
总RNA提取采用一步法进行（TRIzoL试剂），试剂中有酚、胍和硫代氰酸盐，是由Chomczyanski和Sacchi发展的一种改进的提取RNA的方法。
在进行样品均质化和溶解过程中，TRIzoL试剂可以可以破碎细胞，破坏核蛋白复合体，使RNA顺利地解脱出来溶进缓冲液，同时TRIzol试剂可以保持RNA的完整性。
由于RNA在碱性条件下不稳定，因而在整个提取RNA过程中体系始终保持酸性至中性，而在酸性条件下DNA极少发生解离，DNA同蛋白质一起变性后被离心下来，这时溶液分为液体相和组织相，RNA可以完整地保存在液体相中。
在提取液体相后，加入异丙醇来沉淀RNA，最后用75%乙醇来洗RNA。
三、实验方法
（一）均质化及分相
1．玻璃研磨器中放1mLTRIzolRNA提取液
2．冰上研磨
3．研磨液移入1.5mL离心管，室温放置5分钟。
4．加入0.2mL氯仿，盖好盖，用手（或vortex）剧烈振动15秒。
5．再在室温下放置2-3分钟。
6．4℃条件下12000g离心15min，离心管中共分三相，上层为RNA液体相，中层为DNA及碎破组织相，下层为酚-氯仿相。
7．上清液RNA液体相移入新的离心管中。
（二）RNA沉淀
8．与0.5mL的异丙醇混匀后，室温放置10分钟（洗氯仿，沉淀RNA）。
9．4℃离心12000g10分钟。
（三）洗涤
10．倒掉上清液后加入1mL的75%乙醇振荡（vortex）洗RNA（洗掉异丙醇）。
11．4℃条件下7500g离心5分钟。
（四）重溶RNA
12．去掉乙醇。
13．干燥10分钟。
14．用DEPC-SDW50μL溶解RNA沉淀，可在55-60℃条件下温育10min。
15．加入3倍体积的无水乙醇（150μL）放入-20℃或-80℃下保存。
四、所需仪器、耗材
五、所需试剂
1．TRIzol试剂
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（用DEPC-SDW配制）
5．DEPC-H2O
六、思考题
1．TrizoL试剂在实验中的作用是什么？
2．实验过程中，加入氯仿后，溶液共分为哪三相？
3．怎样达到尽可能的无RNA酶的环境？
实验三DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测
一、实验原理
分离出细胞的总RNA或部分RNA之后，根据它们相应的迁移可以通过电泳分辨RNA分子，是检测RNA分子是否降解的关键一步。
电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。
当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。
当DNA/RNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。
因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。
依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可分成两个亚类：
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
聚丙烯酰胺分离小片段DNA/RNA（5—500bp）效果最好，其分辨力极高，相差1bp的DNA片段就能分开，其不足之处为制备和操作较为困难。
琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA/RNA片段。
（一）琼脂糖凝胶
1．琼脂糖浓度
采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子。
2．EB染料的存在
溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。
含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围
凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）]
DNA/RNA分子的分离范围（kb）
0.3
5—60
0.6
1—20
0.7
0.8—10
0.9
0.5—7
1.2
0.4—6
1.5
0.2—3
2.0
0.1—2
3．电泳缓冲液的组成
有几种不同的缓冲液可用于电泳，分别为Tris—乙酸（TAE）、Tris—硼酸（TBE）或Tris—磷酸（TPE），其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8,这些缓冲液均含有EDTA。
这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。
常用的电泳缓冲液的配制
缓冲液
使用液
浓贮存液（每升）
Tris—乙酸（TAE）
1×：
0.04moL/LTris—乙酸
0.001moL/LEDTA
50×：
242gTris碱
57.7mL冰乙酸
100mL0.5moL/LEDTA（PH8.0）
Tris—磷酸（TPE）
1×：
0.09moL/LTris—磷酸
0.002moL/LEDTA
10×：
108gTris碱
15.5mL85%磷酸
40mL0.5moL/LEDTA（PH8.0）
Tris—硼酸（TBE）
0.5×0.045moL/LTris—硼酸
0.001moL/LEDTA
5×：
54gTris碱
27.5g硼酸
20mL0.5moL/LEDTA（PH8.0）
4．加样缓冲液：
缓冲液类型
6×缓冲液
贮存温度
I
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
40%（W/V）蔗糖水溶液
4℃
II
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖水溶液
室温
III
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液
4℃
IV
0.25%溴酚蓝
40%（W/V蔗糖水溶液）
4℃
V
（碱性加样缓冲液）
300mmoL/LNaoH
6mmoL/LEDTA
18%聚蔗糖水溶液
0．15%溴甲酚绿
0．25%二甲苯青FF
4℃
加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。
选用哪一种加样缓冲液纯属个人喜恶。
5．DNA片段长度标记
DNA片段长度标记通常叫作DNAMarker,本实验使用GeneRulerTMDNALadderMix为DNA片段长度标记，分别由100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1031bp、1200bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp组成，DNAMarker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。
二、实验方法
1．50×TAE的稀释：
如制备50mL1×TAE，取1mL50×TAE加入49mL水定容至50mL。
2．制备1%的琼脂糖胶液：
取0.2g琼脂糖溶于20mLTAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至60℃，加入浓度为10mg/mL的EB2μL，使EB的终浓度为1μg/mL。
3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。
4．用胶带封住胶床，放好梳子。
5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固20—60min。
6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子和胶带，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。
7．向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。
8．分别将RNA样品与加样缓冲液混合，（10μLRNA样品+2μL6×加样缓冲液），用移液枪将12μL样品加入加样孔。
9．正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为50mA。
10．电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察，可以看到提取完整的RNA共有三条带，分别是5kb的28SrRNA,2kb18SrRNA及0.1—0.3kb的5SrRNA及tRNA，可以看到28SrRNA的含量约为18SrRNA含量的2倍，说明总RNA完整性良好，无降解。
三、注意事项
溴化乙锭溶液的净化处理：
溴化乙锭是强诱变剂，有中度毒性，可致癌，使用这一染料时务必戴上手套。
1．溴化乙锭浓溶液（浓度＞0.5mg/mL）的净化处理。
①加入足量的水使EB的浓度降低至0.5mg/mL以下。
②加入1倍体积的0.5moL/LKMnO4，小心混匀后再加1倍体积的2.5moL/LHCL，小心混匀，于室温放置数小时。
③加入1倍体积的2.5moL/LNaOH，小心混匀后可丢弃该溶液。
2．溴化乙锭稀溶液（如含0.5μg-1μg/mL溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处理。
1每100mL溶液中加入100mg粉状活性炭。
②于室温放置1小时，不时摇动。
③用滤纸过滤溶液，丢弃滤液。
④用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害物予以丢弃。
四、所需仪器、耗材
五、所需试剂
1．EDTA—Na2·2H2O（乙二胺四乙酸二钠盐）
2．溴化乙锭（EB）
3．琼脂糖
4．Tris（三羟基氨基甲烷）
5．冰醋酸
6．溴酚蓝
7．蔗糖或甘油
8．二甲苯青FF
六、试剂配制
1．加样缓冲液：
（6×）IV型
0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液
如配50mL，加入0.125g溴酚蓝，20g蔗糖，混匀，定容至50mL，4℃保存。
2．TAE，50×浓缩贮存液：
Tris242g，冰醋酸57.1mL，100mL0.5moL/LEDTA,PH=8.0，加600mL水剧烈搅拌，定容至1000mL。
3．0.5moL/LEDTA，PH=8.0
在800mL水中加入186.1gEDTA—Na2·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的PH值至8.0（EDTA—Na2·2H2O在溶液PH值接近8.0时，才能完全溶解），然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
4．溴化乙锭贮存液（10mg/mL）：
在100mL水中加入1g溴化乙锭，用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转移至棕色瓶中，4℃贮存。
七、思考题
1．加样缓冲液的作用是什么？
2．琼脂糖中加入EB的作用是什么？
3．电泳时，为什么DNA/RNA分子将向阳极移动？
实验四DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整
一、实验原理
在分子生物学实验中，提取DNA或RNA后，往往需要测定其纯度和浓度，在纯度达到标准，浓度调整到所需浓度后，才能进行下一步实验。
有条件的实验室，利用DNA/RNA计算器，能够很方便、很迅速地测定DNA/RNA浓度和纯度，但DNA/RNA计算器往往很昂贵。
一般实验室常利用紫外分光光度计来测定DNA/RNA的浓度。
1．对于DNA，根据其在260、280、310nm下紫外吸收值A260、A280、A310，可确定其纯度和浓度。
对于dsDNA：
1.0A260=50μg/mL
ssDNA：
1.0A260=33μg/mL
纯DNA溶液的A260/280应为1.8±0.1，高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
A310值是背景，若盐浓度较高，A310值也高。
2．对于RNA，根据其在230、260、280nm下紫外吸收值A230、A260、A280，可确定其纯度和浓度。
1.0A260=40μg/mL
A260/A280应介于1.7~2.0之间
如果A260/280比值太小，说明可能RNA样品中污染了蛋白或苯酚。
A260/A230的比值应该大于2.0，否则就可能被异硫氰酸胍（TRizoL试剂成分）污染了。
二、实验方法
1．测定前，石英比色杯须用浓盐酸：
甲醇=1：
1溶液浸泡1小时，随后用DEPC-SDW彻底冲洗。
2．以实验三中最终提取的RNA样品为例。
原RNA样品中共有200μL水，向样品中加入2μL3moL/LPH=5.2的乙酸钠溶液，使其终浓度为0.03moL/L，充分混合进行沉淀，4℃12000g下离心5min，去上清液，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀，晾干，然后用DEPC-SDW20μL溶解RNA。
3．用DEPC-SDW对待测样品做1：
1000倍数稀释（2μL样品加入1.998mLDEPC-SDW）。
4．分别测定样品的A260、A280及A230。
5．分别计算样品A260/A280及A260/A230的比值。
三、所需仪器
四、所需试剂
1．浓盐酸
2．甲醇
3．乙酸钠
4．DEPC-SDW
五、试剂配制
3moL/L乙酸钠（PH5.2）250mL溶液的配制：
在200mLDEPC-SDW中溶解102.025g三水乙酸钠，用冰乙酸调节PH值至5.2，加入25μL原溶液DEPC，然后定容至250mL，放置过夜，高压灭菌15min。
六、思考题
1．怎样确定DNA或RNA溶液的浓度？
2．根据你所测得的DNA或RNA的浓度，试计算如果把溶液浓度调节到0．1μg/μL应向溶液中加入多少μL的水？
实验五聚合酶链式反应（PCR）
一、实验原理
聚合酶链式反应（PoLymerasechainreaction,PCR）是一项体外特异扩增特定DNA片段的核酸合成技术，这项技术是分子生物学研究领域的一次创举。
PCR通常需要两个位于待扩增片段两侧的寡聚核苷酸引物，这些引物分别与待扩增片段的两条链互补并定向，使两引物之间的区域得以通过聚合酶而扩增。
反应过程为首先必须使得待扩增DNA（称为模板）置于高温下解链成单链模板，这一过程叫变性；第二步为分别与待扩增的DNA片段两条链的3’端互补的人工合成的寡聚核苷酸引物（Primer15-20bp）在低温条件下分别与模板两条链两侧互补结合，这一过程叫退火，第三步是DNA聚合酶在适当温度下将脱氧核苷酸（dNTP：
dATP,dCTP,dTTPdGTP）沿引物5’—3’方向延伸合成新股DNA，这一过程叫延伸。
变性—退火—延伸，如此循环往复，每一循环产生的新股DNA均能成为下一次循环的模板，故PCR产物是以指数方式即2n扩增的，经过30-35个循环，目的片段可以扩增到一百万倍，在一般PCR仪上，完成这样的反应需几个小时。
PCR原理示意图
二、实验方法
1．在冰上，建立如下PCR反应体系，在PCR管内分别加入：
10×PCR缓冲液2μL
25mMdNTPS1.6μL
2．5mMMgCl21.2μL
Primer1（10μM）0.8μL
Primer2（10μM）0.8μL
模板DNA（1μg/μL）1μL
Taq酶（5Μ/μL）0.2μL
ddH2O12.4μL
总体积20μL
2．将PCR管放入PCR仪中，按如下程序操作。
①94℃预变性2min（开始时模板DNA变性要适当延长）
②94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸2min,共40个循环
③72℃延伸7min（最后一次延伸的时间也要适当延长）
④4℃贮存。
3．取1—5μL反应产物进行当琼脂糖凝胶电泳检测。
三、PCR优化
要得到预期的PCR扩增效果，从中选定最为适用、重复性最好的条件，要试用不同的反应组分和循环参数，其中Mg2+浓度、dNTP浓度、模板DNA含量和Taq酶含量等因素对实验结果都有很大影响，在预备实验中，应分别进行梯度实验和交互组合实验，最终确定优化的PCR反应体系。
四、所需仪器、耗材
五、所需试剂
1．随机引物（Primer）（10μM）
2.dNTP（25mM）
3.模板DNA（1μg/μL）
4．TaqDNA聚合酶（5Μ/μL）
5.10×PCR缓冲液
6．TBE
7．加样缓冲液
8．MgCl2（25mM）
六、试剂配制
1．琼脂糖凝胶电泳所需试剂同实验四一
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