最权威最齐全的PCR汇总及其原理程序.docx

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最权威最齐全的PCR汇总及其原理程序

RTPCR

TPCR-RT-PCR简介

　　反转录·聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。

无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

RTPCR-原理

　　只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RTPCR-过程

　　RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。

在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。

cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。

在一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR在一直观众顺次进行。

　　1、反转录酶的选择

两种方法

1、Money鼠白血病病毒反转录酶

　　有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37°。

　　2、AMV反转录酶

　　有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适温度为42°。

　　2、合成cDNA引物的选择

　　用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。

对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

一步法

　RT-PCR引物的选择：

　　1.随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。

适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。

主要用于单一模板的RT-PCR反应。

两步法

　　2.OligodT适用于具有PolyA尾巴的RNA。

（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA

　　和tRNA不具有PolyA尾巴。

）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

　　3.基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

RTPCR-影响因素

　　RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度,引物退火的温度，扩增的循环数等。

　　1、建议选择0.5-3.0mM（相差0.5mM）的硫酸镁作初步实验。

　　2、对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。

较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。

　　3、大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。

但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。

反向PCR

∙

反向PCR

反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。

反向PCR-简介

PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。

反转录PCR

∙

反转录PCR又称为逆转录PCR，，是指扩增mRNA的一种实验技术。

先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。

RT-PCR反应原理

反转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。

其原理是：

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：

分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

反转录PCR-一、反转录酶的选择

　　1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

　　2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

　　3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：

在Mn2存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

　　4．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：

商品名为SuperScript和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

反转录PCR-二、合成cDNA引物的选择

　　1．随机六聚体引物：

当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

　　2．Oligo（dT）：

是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly（A）尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly（A）RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

　　3．特异性引物：

最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

反转录PCR-三、操作步骤

　　1.总RNA的提取。

　　2.cDNA第一链的合成（ReverseTranscription）：

目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplificationSystemforFirstStrandcDNASynthesis试剂盒为例。

（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA1-5μg，补充适量的DEPCH2O使总体积达11μl。

在管中加10μMOligo（dT）12-181μl，轻轻混匀、离心。

（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

　　然后加入下列试剂的混合物：

　　10×PCRbuffer2μl

　　25mMMgCl22μl

　　10mMdNTPmix1μl

　　0.1MDTT2μl

　　轻轻混匀，离心。

42℃孵育2-5min。

　　（3）加入SuperscriptⅡ1μl，在42℃水浴中孵育50min。

　　（4）于70℃加热15min以终止反应。

　　（5）将管插入冰中，加入RNaseH1μl，37℃孵育20min，降解残留的RNA。

-20℃保存备用。

　　3．PCR：

（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：

　　第一链cDNA2μl

　　上游引物（10pM）2μl

　　下游引物（10pM）2μl

　　dNTP（2mM）4μl

　　10×PCRbuffer5μl

　　Taq酶（2u/μl）1μl

（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。

轻轻混匀，离心。

　　（3）设定PCR程序。

在适当的温度参数下扩增28-32个循环。

为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。

　　（4）电泳鉴定：

行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

　　（5）密度扫描、结果分析：

采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

反转录PCR-四、注意事项

　　1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

　　2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

　　3．内参的设定：

主要为了用于靶RNA的定量。

常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。

其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

　　4．PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。

故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

　　5．防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶处理RNA样品。

（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

巢式PCR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

因此，巢式PCR的扩增非常特异。

巢式PCR-定义

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。

第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

因此，巢式PCR的扩增非常特异。

巢式PCR-原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

 发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

巢式PCR-反应

巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片断。

第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。

 第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。

从而提高反应的特异性。

巢式PCR-实验步骤

第一步：

目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。

第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。

但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。

第二步：

使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。

这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

巢式PCR-应用

一般应用于动物方面。

如：

病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。

在RACE（rapid-amplification of cDNA ends）中，也利用巢式PCR增加特异性。

巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，但也因此是最容易污染的PCR。

[1]

巢式PCR-巢式PCR相对普通PCR的优缺点

优点

1、克服了单次扩增“平台期效应”的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性；

2、由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性；

3、内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因引可以保证整个反应的准确性及可行性。

缺点

进行第二次PCR坟增引起交叉污染的几率大。

为了克服此缺点，可彩用同一反应管中巢式PCR，主要利用内外引物Tm值不同。

如果你已排除引物，酶，RNA提取，逆转录等等其他原因引起的PCR不成功，确定关键原因是模板量低的话，可以用巢式。

但还是建议先排除一下其他可能因素，毕竟普通PCR简单。

荧光定量PCR

荧光定量PCR-概述

　　荧光定量PCR是（realtimefluores-cencequantitativePCR，RTFQPCR）是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

荧光定量PCR-原理

　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

荧光量化PCR原理

荧光定量PCR-应用领域

　　TL988型实时荧光定量PCR仪应用领域

临床疾病诊断：

各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。

　　动物疾病检测：

禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

　　食品安全：

食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

　　科学研究：

医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

　　应用行业：

各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品

多重PCR

∙

多重PCR所属现代词，指的是一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。

多重PCR-简介

一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR（multiplexPCR），又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.

多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，，可系统组合的有:

①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断.④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检.⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.

　　某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:

乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.

多重PCR-多重PCR的特点

①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.

递减PCR

递减PCR（touchdownPCR）是一种PCR（聚合酶链式反应）方法，用来避免非特异性序列的扩增。

PCR中引物的黏合温度（annealingtemperature）决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。

因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。

递减PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。

在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。

这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。

这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。

此外，递减PCR还可与简并引物（degenerateprimer）结合使用，用来推出一段已知肽链的氨基酸序列所对应的DNA碱基序列。

不对称PCR

不对称PCR-简介

一对引物使用不同的浓度，刚开始扩增出双链DNA，当一种引物耗尽，则只产生单链DNA，该单链可用于测序，或作用探针。