早产儿坏死性小肠结肠炎与巨细胞病毒感染的相关性研究.docx
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早产儿坏死性小肠结肠炎与巨细胞病毒感染的相关性研究
早产儿坏死性小肠结肠炎与人巨细胞病毒感染的相关性研究
【摘要】目的探讨早产儿坏死性小肠结肠炎（necrotizingenterocolitis,NEC）的发生、发展、预后与人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）感染的关系。
方法103例早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）分为三组：
NECⅠ组（NECⅠ期，n=35）、NECⅡ组（NECⅡ期，n=38）、NECⅢ期组（NECⅢ期，n=30），选取同期健康的30例正常早产儿为对照组。
检测所有研究对象的HCMV--PP65抗原及HCMV-IgG与HCMV-IgM抗体；根据NEC患儿的预后分为死亡组与存活组并进行分析。
结果四组中HCMV-PP65、HCMV-IgM与HCMV-IgM/IgG阳性率在NECⅢ组最高，在对照组最低；HCMV-IgM/IgG阴性率及HCMV-IgG阳性率在对照组最高，在NECⅢ组最低。
HCMV-PP65阳性率与HCMV-IgM/IgG阳性率在对照组、NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组有升高的趋势，HCMV-IgM/IgG阴性率则有降低的趋势。
四组HCMV-PP65阳性率、HCMV-IgM/IgG阴性率、HCMV-IgM阳性率、HCMV-IgG阳性率与HCMV-IgM/IgG阳性率的差异均有统计学意义（P<0.05）。
存活82例，死亡21例，单因素和多因素logistic回归分析表明：
HCMV-IgG阳性、HCMV-IgM/IgG阴性为NEC患儿预后的保护因素（P<0.05），HCMV-PP65阳性、HCMV-IgM阳性、HCMV-IgM/IgG阳性是NEC患儿预后的危险因素（P<0.05）。
结论巨细胞病毒感染可能是早产儿坏死性小肠结肠炎发生、发展及不良预后重要因素。
【关键词】 坏死性小肠结肠炎; 早产儿；人巨细胞病毒
Correlationstudybetweenpreterminfantswithnecrotizingenterocolitisandcytomegalovirusinfection
【Abstract】ObjectiveToexploretherelationshipbetweenpathogenesis,progressionandprognosisofpreterminfantswithnecrotizingenterocolitis（NEC）andhumancytomegaloviru（HCMV）infection.Methods103casespretermnecrotizingenterocolitisweredividedintothreegroups：
NECⅠgroup（NECⅠstage，n=35）,NECⅡgroup（NECⅡstage，n=38）andNECⅢgroup（NECⅢstage，n=30）,and30healthypreterminfantatthesameperiodwerechosenasthecontrolgroup.HCMVPP65antigenandHCMV-IgG、HCMV-IgMantibodyweredeterminedinallcases；ChildrenwithNECweredividedintodeathgroupandalivegroupaccordingtotheprognosisandwereanalysised.ResultThespositiverateofHCMV-PP65,HCMV-IgMandHCMV-IgM/IgGintheNECⅢgroupwerethehighestamongthefourgroups.ButthespositiverateofHCMV-PP65,HCMV-IgMandHCMV-IgM/IgGincontrolgroupwerethelowestamongthefourgroups.ThenegativerateofHCMV-IgM/IgGandthepositiverateofHCMV-IgGwerethehighestinthecontrolgroup,butwerethelowest.PositiverateofHCMV-PP65andHCMV-IgM/IgGhadatendencytoriseinthecontrolgroupNECⅠgroup,NECⅡgroupandNECⅢgroup.ThenegativerateofHCMV-IgM/IgGhadatendencytoreduceinthecontrolgroupNECⅠgroup,NECⅡgroupandNECⅢgroup.ThedifferenceofthespositiverateofHCMV-PP65,HCMV-IgM，HCMV-IgG，HCMV-IgM/IgGandthenegativerateofHCMV-IgM/IgGamongthefourgroupshadstatisticalsignificance（P<0.05）.82casessurvivedand21casesdied,Singlefactorandmultiplefactorslogisticregressionanalysisshowedthat:
HCMVIgGpositiveandHCMVIgM/IgGnegativewereprotectivefactorsfortheprognosisofchildrenwithNEC.（P<0.05）.HCMV-PP65positive，HCMV-IgMpositiveandHCMV-IgM/IgGpositivewereriskfactorsfortheprognosisofchildrenwithNEC.（P<0.05）.Conclusion HCMVinfectionmayplayanimportantroleinpathogenesis,progressionandpoorprognosisofpreterminfantswithNEC.
【Keywords】 necrotizingenterocolitis;preterm; humancytomegalovirus
坏死性小肠结肠炎（necrotizingenterocolitis,NEC）是一种由于多种原因引起的肠黏膜损害而引起缺血、缺氧，导致小肠、结肠发生弥漫性或局部坏死的一种获得性疾病[1]，是早产儿消化系统极为严重的疾病[2]。
早产儿胃肠道功能发育不成熟，同时早产儿易发生缺氧窒息，造成胃肠道的缺血、坏死、肠壁通透性增加，消化道粘膜屏障功能破坏，所以早产儿容易发生NEC[3]，具有较高的病死率和发病率[4,5]。
最近有多个调查研究[6,7]发现：
NEC与人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）感染具有密切的关系。
而HCMV是重要的新生儿感染病原之一[8]，HCMV也是引起胎儿宫内感染的常见病毒[9]，有研究[10]认为：
生后2周内出现症状者多为先天宫内感染。
同时HCMV感染在孕妇中发生率很高，孕妇感染后可通过胎盘屏障传给胎儿，也可通过产道分泌物、乳汁、飞沫传给新生儿，有研究[11,12]显示2008～2010年孕妇尿液中巨细胞病毒检测的阳性率分别为7.69%、14.33%、13.86%、17.43%，新生儿感染率分别为9.90%、10.89%、12.38%、20.03%。
但HCMV感染对早产新生儿坏死性小肠结肠炎的发生、发展及预后究竟怎样的影响？
尚未见文献报道，本文即对HCMV感染对早产儿NEC的发生、发展及预后的关系进行探讨，为临床预防、治疗及预测NEC的发展转归提供理论依据。
1.资料与方法
1.1一般资料
选取2013年12月-2016年12月期间本院新生儿科就诊且确诊为早产儿NEC的患儿103例，患儿分为：
NECⅠ期（NECⅠ组）35例、NECⅡ期（NECⅡ组）38例、NECⅢ期（NECⅢ组）30例，分别对应为NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组。
NEC分期和诊断标准参照改良的bell评分标准[13]，选取同期正常30例正常早产儿作为对照组。
所有研究对象纳入标准为：
胎龄在28周～37周之间，出生体重≥1700g，出生后24h初诊收治于NICU治疗的早产儿，住院时间超过3d，排除其他病毒感染性疾病。
四组患儿的年龄、体重、性别构成比无显著性差异（P>0.05），具有可比性。
1.2方法
1.2.1巨细胞病毒感染的检测方法
抗原检测：
应用荧光免疫组化法检查所有研究对象外周静脉血中HCMV--PP65抗原，检测试剂盒为HCMVBrite（荷兰IQ Products公司。
明确诊断为NEC的患儿在诊断第二天、对照组在入组后第二天晨抽取外周静脉血2ml、以乙二胺四醋酸（EDTA）抗凝后制片，在荧光显微镜下计数5万个外周血白细胞，以抗原阳性细胞≥5个判为阳性，结果分为HCMV--PP65阳性与HCMV--PP65阴性。
抗体检测：
采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测所有研究对象血清中HCMV-IgG与HCMV-IgM，明确诊断为NEC的患儿在诊断第二天、对照组在入组的当天抽取外周静脉血2ml，2h内3000r/min离心10min，分离血清，置于-20℃冰箱保存备用，一周内完成检测。
试剂盒为DIESSE公司产品。
检测检测波长为450nm，待检血清孔吸光度值（OD）值/阴性对照孔OD值≥2.1者，即可判定为阳性，结果分为：
IgM阴性，IgG阴性者（未受感染者）；IgM阴性，IgG阳性（既往感染者）；IgM阳性，IgG阴性者（原发感染者）；IgM阳性，IgG阳性者（激活感染者）。
1.2.2治疗及预后随访的方法
明确诊断为NEC的患儿，立即进行严格禁食、补液、营养支持及二代头孢类抗菌药物或广谱抗菌药物进行常规内科保守治疗，治疗1d后症状无明显改善转为外科手术治疗；肠穿孔、腹膜炎症状体征明显，腹壁明显红肿等符合手术指征的NEC患儿立即采用外科手术治疗。
记录患儿的性别、胎龄、出生体重、胎膜早破、宫内窘迫、分期、机械通气、肺炎、感染性休克、代谢性酸中毒、贫血、肠穿孔、弥散性血管内凝血（DIC）、应激性胃出血、HCMV-PP65阳性、HCMV-IgM/IgG均为阴性、HCMV-IgM阳性、HCMV-IgG阳性与HCMV-IgM/IgG均为阳性例数及情况。
跟踪随访NEC患儿，根据NEC患儿的预后分为死亡组与存活组，其中死亡包括院内死亡、转外科手术治疗后死亡及因病重放弃治疗后难免死亡的患儿。
1.2.3统计学处理方法
采用SPSS18.0软件包处理数据，计数资料采用百分比表示，卡方（χ²）检验；计量数据采用均数士标准差（
±s）表示，两组资料样本采用独立样本t检验；单因素和多因素logistic回归分析患儿死亡的影响因素。
采用双侧检验，检验水准α=0.05。
2.结果
所有患儿均成功跟踪记录，获取完整资料，均纳入统计。
2.1四组研究对象巨细胞病毒感染抗原（HCMV-PP65）、抗体（HCMV-IgM/IgG）的比较
四组研究对象中，HCMV-PP65阳性率在NECⅢ组最高（53.33%），在对照组最低（13.33%）；HCMV-IgM/IgG阴性率在对照组最高（50%），在NECⅢ组最低（10%）；HCMV-IgM阳性率在NECⅢ组最高（56.67%），在对照组最低（10%）；HCMV-IgG阳性率在对照组最高（33.33%），在NECⅢ组最低（6.67%）；HCMV-IgM/IgG阳性率在NECⅢ组最高（26.67%），在对照组最低（10%）。
HCMV-PP65阳性率与HCMV-IgM/IgG阳性率在对照组、NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组有升高的趋势，HCMV-IgM/IgG阴性率则有降低的趋势。
对照组、NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组患儿的HCMV-PP65阳性率、HCMV-IgM/IgG阴性率、HCMV-IgM阳性率、HCMV-IgG阳性率与HCMV-IgM/IgG阳性率的差异均有统计学意义（P<0.05），其中HCMV-PP65阳性率在对照组、NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组两两之间差异均有统计学意义（P<0.05）；HCMV-IgM/IgG阴性率除了在NECⅡ组及NECⅢ组之间差异无统计学意义（P>0.05）外，在对照组于NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组两两之间差异均有统计学意义（P<0.05）；HCMV-IgM阳性率除了NECⅠ组与NECⅡ组之间差异无统计学意义（P>0.05）外，在对照组、NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组两两之间差异均有统计学意义（P<0.05），HCMV-IgG阳性率除了对照组与NECⅡ组之间差异无统计学意义（P>0.05）外，在对照组、NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组两两之间差异均有统计学意义（P<0.05）；HCMV-IgM/IgG阳性率除了NECⅠ组与NECⅡ组之间差异无统计学意义（P>0.05）外，在对照组、NECⅠ组、NECⅡ组及NECⅢ组两两之间差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1四组研究对象巨细胞病毒感染抗原、抗体的比较
组别
n（例）
HCMV-PP65阳性数（率）
HCMV-IgM/IgG阴性
HCMV-IgM阳性数（率）
HCMV-IgG阳性数（率）
HCMV-IgM/IgG阳性
对照组
30
4（13.33%）
15（50%）
3（10%）
10（33.33%）
2（10%）
NECⅠ组
35
10（28.57%）a
9（25.71%）a
15（42.86%）a
6（17.14%）a
5（14.29%）a
NECⅡ组
38
15（39.47%）ab
5（13.16%）ab
16（42.11%）a
11（28.95%）b
6（15.79%）a
NECⅢ组
30
16（53.33%）abc
3（10%）ab
17（56.67%）abc
2（6.67%）abc
8（26.67%）abc
x2
6.758
9.327
8.413
9.546
4.562
P
0.004
0.000
0.001
00.000
0.008
注：
HCMV-IgM阳性为同时HCMV-IgG阴性；HCMV-IgG阳性为同时HCMV-IgM阴性；a表示与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），b表示与NECⅠ组比较差异有统计学意义（P<0.05），c表示与NECⅡ组比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2NEC患儿预后影响因素分析
103例NEC患儿存活82例，为存活组；死亡21例，为死亡组。
2.2.1单因素分析
两组患儿的性别、胎龄、出生体重、胎膜早破及贫血的差异均无统计学意义（P>0.05），两组患儿的宫内窘迫、分期、机械通气、肺炎、感染性休克、代谢性酸中毒、肠穿孔、弥散性血管内凝血（DIC）、应激性胃出血、HCMV-PP65阳性、HCMV-IgM/IgG阴性、HCMV-IgM阳性与HCMV-IgG阳性、HCMV-IgM/IgG阳性等14个项目的差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2死亡组和存活组的单因素分析
影响因素
存活组（n=82）
死亡组（n=21）
T/χ2
p值
性别（女/男）
35/47
10/11
0.279
0.240
胎龄（周）
33.85±2.31
32.07±2.52
0.351
0.098
出生体重（克）
1702.82±125.68
1694.23±134.96
0.296
0.133
胎膜早破（%，n）
29.27%（24）
33.33%（7）
0.846
0.071
宫内窘迫（%，n）
6.83%（12）
23.81%（5）
11.623
0.000
分期（NECⅢ/NECⅠ+NECⅡ）
2.44%
（2）
80.95%（17）
39.494
0.000
机械通气（%，n）
6.10%（5）
38.10%（8）
17.383
0.000
肺炎（%，n）
40.24%（33）
57.14%（12）
2.472
0.024
感染性休克（%，n）
2.44%
（2）
42.86%（9）
28.755
0.000
代谢性酸中毒（%，n）
10.98%（9）
52.38%（11）
14.564
0.000
贫血（%，n）
20.73%（17）
19.05%（4）
0.287
0.179
肠穿孔（%，n）
7.32%（6）
23.81%（5）
9.562
0.000
DIC（%，n）
1.22%
（1）
19.05%（4）
26.413
0.000
应激性胃出血（%，n）
21.95%（18）
28.57%（6）
1.968
0.0421
HCMV-PP65阳性（%，n）
34.15%（28）
61.90%（13）
5.966
0.006
HCMV-IgM/IgG阴性
18.30%（15）
9.52%
（2）
2.874
0.0277
HCMV-IgM阳性（%，n）
41.46%（34）
66.67%（14）
3.341
0.012
HCMV-IgG阳性（%，n）
20.73%（17）
9.52%
（2）
2.997
0.0286
HCMV-IgM/IgG阳性
15.85%（13）
28.57%（6）
3.015
0.0203
注：
HCMV-IgM阳性为同时HCMV-IgG阴性；HCMV-IgG阳性为同时HCMV-IgM阴性。
2.2.2多因素logistic回归分析
将单因素分析有显著性差异的宫内窘迫、分期、机械通气、肺炎、感染性休克、代谢性酸中毒、肠穿孔、弥散性血管内凝血（DIC）、应激性胃出血、HCMV-PP65阳性、HCMV-IgM/IgG阴性、HCMV-IgM阳性与HCMV-IgG阳性、HCMV-IgM/IgG阳性等14个项目进行多因素logistic回归分析，结果显示：
除了HCMV-IgG阳性、HCMV-IgM/IgG阴性为NEC患儿预后的保护因素外，分期、机械通气、感染性休克、代谢性酸中毒、肠穿孔、弥散性血管内凝血（DIC）、应激性胃出血、HCMV-PP65阳性、HCMV-IgM阳性、HCMV-IgM/IgG阳性为NEC患儿预后的危险因素，见表3。
表3NEC患儿预后多因素logistic分析的相关参数
变量
b
SE
waldx2
P
OR（95%CI）
分期（NECⅢ/NECⅠ+NECⅡ）
0.047
0.002
8.141
0.000
1.701（1.078-2.540）
机械通气
0.134
0.010
6.301
0.000
1.528（1.017-2.463）
感染性休克
0.085
0.006
7.362
0.000
1.031（1.345-2.986）
代谢性酸中毒
0.193
0.017
5.476
0.000
1.547（1.050-2.584）
肠穿孔
0.206
0.025
5.001
0.001
1.404（1.208-2.27）
应激性胃出血
0.097
0.007
6.985
0.000
1.015（1.009-1.827）
DIC
0.352
0.194
3.897
0.028
1.603（1.035-2.168）
HCMV-PP65阳性
0.224
0.058
4.753
0.006
1.656（1.071-2.267）
HCMV-IgM/IgG阴性
-0.317
0.156
3.995
0.022
1.789（1.214-2.546）
HCMV-IgM阳性
0.293
0.134
4.315
0.007
1.514（1.064-2.173）
HCMV-IgG阳性
-0.314
0.199
4.009
0.015
0.891（0.674-0.995）
HCMV-IgM/IgG阳性
0.308
0.125
3.851
0.024
1.703（1.210-2.842）
3.讨论
预防NEC的发生、根据病因积极治疗NEC对降低NEC的发生与死亡率具有重要的作用。
而目前认为NEC发生、发展可能由多种因素，如低体重、非母乳喂养[14]、肠道菌群建立不完善、血制品应用[15]等引起，但确切病因还不完全了解。
最近NEC与HCMV感染的关系被先后报道[6,7]，为临床诊断和治疗提供了新的思路[16]。
HCMV属人类疱疹病毒β亚科，HCMV在人群中感染非常普遍，普通人群的血清阳性率达40-100%，多数感染者无临床症状，但在一定条件下可以发展为肠炎、脑炎、心肌炎和其他特定的器官疾病，免疫功能低下的人群如新生儿、实体器官移植、HIV感染者和免疫抑制剂治疗的患者感染会引起严重终末器官疾病甚至导致感染者死亡[17]，孕期母体感染后，病毒可通过胎盘、生殖道逆行传播给胎儿，也可以通过密切接触传播，包括唾液、尿液、血液、乳汁等传播。
但对于早产儿NEC与HCMV的关系缺乏相应的临床研究。
本研究对健康早产儿及患有不同临床分期的NEC早产儿进行临床研究发现：
健康早产儿、NECⅠ期、NECⅡ期及NECⅢ期患儿中HCMV-PP65阳性率在NECⅢ期患儿中最高（53.33%），在健康早产儿中的检出率最低（13.33%）；HCMV-IgM/IgG阴性率在健康早产儿中最高（50%），在NECⅢ期患儿中最低（10%）；HCMV-IgM阳性率在NECⅢ期患儿中最高（56.67%），在健康早产儿中最低（10%）；HCMV-IgG阳性率在健康早产儿中最高（33.33%），在NECⅢ期患儿中最低（6.67%）；HCMV-IgM/IgG阳性率在NECⅢ期患儿中最高（26.67%），在健康早产儿中最低（10%）。
同时HCMV-PP65阳性率与HCMV-IgM/IgG阳性率在健康早产儿、NECⅠ期、NECⅡ期及NECⅢ期有升高的趋势，HCMV-IgM/IgG阴性率在健康早产儿、NECⅠ期、NECⅡ期及NECⅢ期中则有降低的趋势；并且HCMV-PP65阳性率、HCMV-IgM/IgG阴性率、HCMV-IgM阳性率、HCMV-IgG阳性率与HCMV-IgM/IgG阳性率在健康早产儿、NECⅠ期、NECⅡ期及NECⅢ期患儿中的差异均有统计学意义。
HCMV-PP65是HCMV被膜磷蛋白，用于检测HCMV急性期或恢复期感染，HCMV-PP65蛋白是病毒复制早期产生的一种结构蛋白，是病毒活动性感染的显著标志，可在病毒感染出现症状前的几天至一周出现阳性，敏感度和特异度均较高，可准确反应体内病毒感染的活动情况。
HCMV感染后可引起机体的体液免疫反应，会产生特异性抗体，间接反映HCMV感染的存在及机体的保护力，HCMV-IgM是主要的初次免疫
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