L乳酸高产菌株的选育.docx
《L乳酸高产菌株的选育.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《L乳酸高产菌株的选育.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
L乳酸高产菌株的选育
21
No.1.2004
食品技术
L（+-乳酸高产菌株的选育
徐子钧1李剑1马建芳2王淑芳2刘如林1（1.南开大学生命科学学院天津・300071; 2.天津南开戈德集团天津・300071
摘要:
以代谢调控发酵理论为依据,利用紫外线、亚硝基胍、DES等理化因子对乳酸菌进行复合诱变,再用高浓乳酸钙平板、纯乳酸平板、琥珀酸平板筛选得到一株高产L（+-乳酸的正向突变株M7,平均发酵产量为90g/L,比原菌株产量提高30%,对糖的转化率为88.9%。
关键词:
乳酸菌;L-乳酸;菌种选育
中图分类号:
TS201.3文献标识码:
A文章编号:
1005-9989（200401-0021-03
BreedingofL（+-Lacticacidbacteria
XUZi-jun1LIJian1MAJian-fang2WANGShu-fang2LIURu-lin1
（1.LifeCollege,NankaiUniversity,Tianjin,300071;2.TianjinNankaiGuardCo.,Ltd,Tianjin,300071
Abstract:
Multiplemutagenesis（U.V.,NTG,DESwereappliedandtheL（+-lacticacidproducingmutantwasselectedbasedonthepathwayanalysisandmetabolicengineeringtheory.Afterfermentationfor72hours,themutantstraingaveaL（+-lacticacidoutputof90g/L,30%higherthantheparentstrainandsucroseconversionof88.9%.
Keywords:
lacticacidbacteria;L（+-lacticacid;breeding
0前言
乳酸是一种重要的有机酸,可分为D型和L型乳酸,人体只能代谢其中的L型乳酸,而且L-乳酸及其盐类和衍生物在医疗、农业等许多部门都有广泛的用途[1]
。
尤其近几年来,人们利用L-乳酸聚合生成的聚L-乳酸制造生物降解塑料,用以解决日益严重的环境污染问题,具有重大意义[4-6]。
然而,从自然界筛选的野生型菌株往往产量不高,达不到生产要求,产量的提高是由多基因作用的结果[7]。
乳酸高产菌应具有以下生化特征:
较高的乳酸脱氢酶活性,弱化的丙酮酸脱氢酶系;能耐高浓度的乳酸盐;不具有以乳酸为唯一碳源而生长的能力。
本文的育种思路:
高浓度乳酸钙平板上挑取菌落,筛选出耐高酸的菌株;利用琥珀酸平板筛选出EMP途径强化TCA途径减弱的菌株;在以乳
收稿日期:
2003-10-08
作者简介:
徐子钧（1977-,硕士研究生,研究方向为资源细菌及工程。
酸盐为唯一碳源的平板上不长的菌落即筛选出不分解利用乳酸的菌株。
最后获得正向突变株。
1材料与方法1.1菌种
从自然界筛选到的Lactobacillussp.S3,已证实其产物为光学纯度95%以上的L（+-乳酸,发酵产率为68g/L。
1.2培养基
MRS培养基[7];
高乳酸钙平板:
MRS培养基加入一定浓度的乳酸钙;
乳酸平板:
用1%的乳酸代替MRS培养基中的葡萄糖成分;
琥珀酸平板:
用3%琥珀酸代替MRS培养基中的葡萄糖,其他成分不变。
1.3复合诱变方法
1.3.1紫外线处理培养乳酸菌至对数生长期,制备菌悬液;将菌液进行紫外处理,照射时间为致死
22食品技术
No.1.2004
率70%~80%的时间,加入到新鲜种子培养液中,避光条件下培养24h。
1.3.2亚硝基胍（NTG处理加入亚硝基胍,使其终浓度为100ìg/mL,37℃振荡反应30min和60min后,用冷的生理盐水大量稀释。
1.3.3硫酸二乙酯（DES诱变离心培养至对数期的菌液,用pH7.0的缓冲液洗涤菌体2次,并稀释成浓度为108cfu/mL菌悬液。
取32mLpH7.0的缓冲液、8mL菌悬液、0.4mLDES充分混合（DES浓度为1%V/V,30℃恒温振荡处理致死率为70%~80%的时间后,加入0.5mL25%Na2S2O3溶液/mL菌液中止反应。
1.4高产菌株的筛选
1.4.1初筛将经过复合诱变的菌液涂布于含有高浓度乳酸钙的平板上,筛选生长的菌株。
然后对筛选到的菌株,在琥珀酸平板上和乳酸平板上进一步筛选。
筛选在琥珀酸平板上比出发菌株延迟出现菌落的菌株,即强化EMP途径、减弱TCA循环的变异株。
筛选应在以乳酸为唯一碳源平板上不生长,即筛选出不分解利用乳酸的菌株。
对筛选到的正向突变株,反复在高乳酸钙平板上转代,纯化菌株并强化诱变效果。
1.4.2复筛将初筛获得的菌株转入发酵培养基逐个发酵进行产量测定,并对筛选到的菌株做产物的光学纯度鉴定。
1.5分析方法
1.5.1L（+-乳酸测定用酶膜生物传感仪测定。
1.5.2总酸测定采用EDTA滴定,参见文献[7]
。
2结果与讨论
2.1紫外线处理对S3菌株存活的影响
紫外线处理后,结果如图1所示。
紫外诱变处理5~6min,致死率为70%~80%。
2.2NTG处理对S3菌株存活的影响
经紫外诱变后的S3菌株再经NTG处理后其致死曲线见表1。
经过NTG诱变处理30min后,致死率为83.3%。
表1NTG对S3菌株存活率的影响
作用时间（min
03060748402致死率（%
—
83.3
91.7
在高浓度乳酸钙平板上筛选到的菌株M23与S3
相比,其产量提高了20%（图2。
2.3DES处理对M23菌株存活的影响
紫外线、NTG处理后筛选到的菌株M23再经DES处理,其致死曲线见图3。
经过DES处理后,M23菌株致死率70%~80%时的致死剂量为5min。
2.4菌种选育结果
出发菌株经过5min紫外线照射后,避光培养过夜,再经过NTG、DES复合诱变,在11%的高浓度乳酸钙平板上选出50株菌,用琥珀酸平板和乳酸平板筛选,并进行产量测定,经复筛选出M7菌株。
在相同的条件下,M7和出发菌株S3发酵情况见表2。
经过复合诱变处理后,菌株S3和M7分别产乳酸69g/L和90g/L,经复合诱变后的菌株M7比原菌株S3产量提高30%。
表2诱变处理对LactobacillusS3产酸的影响时间（h
0244872残糖（g/L1205738.520S3乳酸（g/L0314269残糖（g/L12068190M7
乳酸（g/L
49
72
90
2.5诱变菌株的遗传稳定性
经传代10代后,M7菌株产酸仍可达到原水平,可见M7菌株有较强的遗传稳定性。
3小结
3.1经过复合诱变处理,得到了高产L（+-乳酸的
23
No.1.2004
食品技术
菌株。
在相同的条件下,经多次实验考察,M7和出发菌株S3分别产乳酸86g/L和66g/L,产量提高30%。
3.2根据代谢调控理论,挑选在高浓度乳酸钙的平板、琥珀酸平板上比出发菌株生长滞后,并在乳酸平板上不生长的菌株来筛选高产乳酸菌株,大大减小了工作量。
参考文献:
[1]曹本昌,等.L-乳酸研究综述.食品与发酵工业,1993,
（3:
56-60
[2]Severson,etal.Lactobacillusdelbrueckiispp.Bulgaricus
strainandfermentationprocessforproducingL
（+-lacticacid.UnitedStatesPatent:
5416020,1995[3]AliDemirci,et.al.EnhancedproductionofD（+-lactic
acidbymutantsofLactobacillusdelbrueckiiATCC9649.JournalofIndustrialMicrobiology,1992（11:
23-28
[4]李学梅,林建平,等.固定化米根霉电渗析发酵生产L-乳酸的研究.食品科学,1996,17（9:
12-16
[5]杨虹,史美榕.L-乳酸发酵的研究Ⅱ-L-乳酸生产菌的
选育.1994,22（2:
103-106
[6]乔长晟,汤凤霞,等.L-乳酸高产菌株的诱变选育.研究
与探讨,2002,23（2:
35-37
[7]杨洁彬,等.乳酸菌-生物学基础及应用.北京:
中国轻
工业出版社,1996
（上接第20页
1.4振动或逐步脉冲的高压
振动或逐步脉冲的高压就是对肌肉系统加一次压,短时间停顿后再释放一次压力,这样重复几次,此过程中并不需要把样品从压力容器中移开。
系统的温度在每个阶段并不完全相同,这主要依赖于处理条件,所以高压处理发生在变化的温度和压力状况下（表4,振动加压看起来对抑制微生物比对引起肌肉组织的变化或影响凝胶结构性质更有效（Carballoetal,2001。
表4振动或逐步脉冲的高压处理样品条件
肉糊
400MPa/2×16,4×8min/70℃
参考文献:
[1]CheftelJC,CulioliJ.Effectofhighpressureonmeat:
A
review.MeatScience,1997,46（3:
211-236
[2]AngsupanichK,EddeM,LedwardDA.Effectsofhigh
pressureonthemyofibrillarproteinsofcodandturkeymuscle.JournalofAgricultureandFoodChemistry,1999,47（1:
92-99
[3]MessensW,VanCampJ,HuyghebaertA.Theuseof
highpressuretomodifythefunctionalityoffoodproteins.TrendsinFoodScienceandTechnology,1997,8（4:
107-112
[4]AsgharA,SamejimaK,YasuiT.Functionalityofmuscle
proteinsingelatinmechanismsofstructuresmeatproducts.CRCCriticalReviewsinFoodScienceandTechnology,1985,22（1:
27-106[5]CarballoJ,FernándezP,JiménezColmeneroF.Textureof
uncookedandcookedlow-andhigh-fatmeatbattersasaffectedbyhighhydrostaticpressure.JournalofAgricultureandFoodChemistry,1996,44（7:
1624-1625[6]SuzukiT,MacfarlaneJJ.Modificationoftheheat-setting
characteristicsofmyosinbypressuretreatment.MeatScience,1984,11（4:
263-274
[7]IkeuchiY,TanjiH,KimK,SuzukiA.Dynamicrheological
measurementsonheat-inducedpressurizedmyosingels.JournalofAgricultureandFoodChemistry,1992,（10:
1751-1755
[8]AshieINA,LanierTC.Highpressureeffectson
gelationofsurimiandturkeybreastmuscleenhancedbymicrobialtransglutaminase.JournalofFoodScience,1999,64（4:
704-708
[9]Fernández-MartínF,FernándezP,CarballoJ,Jiménez-
ColmeneroF.Pressure/heatcombinationsonporkmeatbatters:
Proteinthermalbehaviorandproductrheologicalproperties.JournalofAgricultureandFoodChemistry,1997,45（11:
4440-4445
[10]MacfarlaneJJ,McKenzieIJ,TurnerRH.Pressure-
heattreatmentofmeat:
Changesinmyofibrillarproteinsandultrastructure.MeatScience,1986,17（3:
161-176[11]CarballoJ,CofradesS,Fernández-MartínF,Jiménez-
ColmeneroF.Comparisonofcontinuousandoscillatoryhighpressureinmeatbattersmadewithdifferentrawmaterial.Proceedingsof47thInternationalCongressofMeatScienceandTechnology.Kraków,Poland,2001
升级会员 