小麦族赖草属植物与近源二倍体物种遗传多样性分析.docx

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小麦族赖草属植物与近源二倍体物种遗传多样性分析

论文独创性声明

本人郑重声明：

所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。

尽我所知，除了中文特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做出的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示诚挚的谢意。

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年月日

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年月日

导师签名：

年月日

第1章文献综述

1.材料简介

1.1小麦族（Triticeae）

小麦族（Triticeae）属于禾本科（Poaceae）植物中一种最具有经济价值的类群[1]，它属于一年生或者多年生的草本。

小麦族包括25个属近400个种，在世界各地均有分布，并且它是麦类作物育种中非常重要的基因来源。

小麦族不只包括小麦（Triticumaestivum）、大麦（Hordeumvulgare）、黑麦（Secalecereale）,而且还包括很多具有重要经济价值的优质的多年生牧草，如冰草（Agropyroncristatum）、羊草（Leymuschinensis）、华山新麦草（Psathyrostachyshuashanica）、偃麦草（Lophyrumelongatum）等。

1.2赖草属（LeymusHochst）

赖草属（LeymusHochst.）是属于小麦族（TriticeaeDumortier）的禾本科植物的一个非常重要的多年生属。

我国是世界上赖草属种类最多的国家[2]，有大约27个种，三个亚种和三个变种，主要在东北、华北、西北和西南地区分布。

从全世界范围看，它的分布特别广泛，种类也很多，大概有30个种和19个亚种，在地域上大部分物质主要集中在北美和中亚的高山区域，在范围上从北海沿岸穿越中亚、东亚一直到阿拉斯加和北美西部都有分布[3]。

赖草属为多年生植物，具下伸的根状茎，秆直立且粗硬，单生或呈疏丛状，生殖枝高45～100厘米，营养枝高20～35厘米，茎部叶鞘残留呈纤维状。

叶片长为8—30厘米，宽为4—7毫米，深绿色，平展或内卷。

穗状花序直立，长10—15厘米，宽0.8—1毫米，穗轴每节小穗1～4枚，长为10—15毫米，含小花4—7朵，小穗轴被短柔毛，颖锥形，长8—12毫米，正覆盖小穗，外稃披针形，被短柔毛，先端渐尖或有1—3毫米长的短芒，第一外稃长为8—10毫米，内稃与外稃等长，先端略显分裂。

赖草属植物具有很高的饲用价值，是草原和草甸的优良牧草品种，并且具有很高的适应能力，能适应各种较恶劣的环境，如干旱、寒冷和盐碱地等[4]。

然而，我们的麦类农作物并不具有这些优良性状，因此需要改进，所以赖草的这些优良基因可作为我们改进牧草和麦类作物的良好三级基因来源，所以赖草具有很高的利用价值。

赖草属是一个从四倍体到十二倍体均有的多倍体物种，但赖草属物种的确切基因组成至今仍不明确。

研究人员通过染色体配对（Dewey,1970a,1972,1976[19-21];WangandHsiao,1984[5]）和用重复序列做的探针进行物种基因组Southern（ZhangandDvorak,1991[6]）杂交研究表明，赖草的一个基因组来自新麦草属（PsathyrostachysNevski）的Ns基因组。

关于赖草属的另一个基因组的来源，很多学者进行了很多研究，但是因为缺乏充分的实验数据，至今也没有统一的结论。

Zhang等（1991）[6]用克隆的重复序列基因做探针，进行Southern杂交研究草属的另一个基因组的来源。

结果显示，DNA杂交带证明赖草属里没有J基因组，推测出赖草属可能含新麦草属里的另一个N基因组，并提出N1N1N2N2的基因假设；Sun等（1995A）[7]通过属间杂交又认为L.secalinus里可能还有3～4条J基因组染色体。

总之，赖草属种的Xm基因组的来源问题到现在还没有完全弄明白，关于赖草属物种中的Ns基因组究竟属于新麦草属中的哪一个种，还有待进一步研究。

1.3猬草属（HystrixMoench）

猬草属是禾本科小麦族非常重要的多年生小属，其显著特征为颖强烈退化形成针状或没有。

Moench依据这一特征，以HystrixpatulaMoench作为模式种建立起猬草属。

研究表明，猬草属是StH染色体组[8]，主要分布在中亚和西亚地区。

它是优良的牧草，其饲用价值很高。

因此，具有较高研究价值。

目前，人们通常将猬草属归为赖草属，但也有将其归为一个单独的属[9]。

比如，北美和欧洲一些学者,把它归入Elymus里[10]；Jessen和Wang[11]研究发现猬草属物种Hy.coreana和Hy.californica含有和赖草属（LeymusHochest.）（NsXm基因组）一样的基因组组成,并且将他们组合到Leymus中；张海琴等人的研究表明：

（1）H．Patula是StH基因组；

（2）Hduthieissp．duthiei和Hduthieissp．1ongearistata具Ns基因组，与Ee基因组存在重复片段[12]。

周永红等也支持Hy.patula含有StH基因组,其中St基因组可能起源于Pseudoroegneria,而H基因组可能起源于Hordeum[13]。

此外，周永红等利用RAPD特异标记来研究东北猬草染色体组成。

结果表明，东北猬草含有Ns染色体组，而不含St和H染色体组[14]。

1.4新麦草属（PsathyrostachysNevski）

新麦草属（PsathyrostachysNevski）属于禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）里面比较小的属，最早是由苏联植物学家Nevski发现的。

从大麦属（Hordeum）中分离出大概10种，并且这10种都是长短根的多年生优质牧草。

我国仅有4种，分别为华山新麦草（P.huashanica）、毛穗新麦草（P.Langinosa）、单花新麦草（P.kronenburgii）和新麦草（P.juncea）。

其中，华山新麦草是我国华山特有的物种，并且是国家I类濒危保护野生农作物亲缘物种[15]。

华山新麦草仅仅生活在华山，拥有一些优良的性状，比如抗旱、抗寒、耐瘠薄、优质、早熟、高抗小麦的条锈病和全蚀病、中抗赤霉病等，所以华山新麦草的这些优良基因可用于小麦性状的改良上。

1.5冰草属（（AgropyronGaertn）

冰草属（AgropyronGaertn．）是禾本科植物中小麦族里面的多年生异花授粉的草本，是小麦重要的野生近缘属[19]。

冰草属植物在全世界大约有15种，大多数分布在欧亚大陆的寒温带地区的沙质地和草原上，其生长海拔大约为1000～1500m，少数种可以生存在高达2750m的高山寒冷地区，如细茎冰草[20]。

冰草属中常见的还有扁穗冰草（A．cristatumGaertn．）、蒙古冰草（A.mogoligumKeng.）。

该属植物茎叶特别柔嫩，营养非常丰富，常作为优良牧草而被广泛栽培。

目前，国外有关冰草的研究主要集中在生态建设、耐牧性和营养物质的贮存和运输等方面[21-22]。

冰草属植物具有很强的抗寒、抗旱和耐盐性等特征，对小麦常见白粉病、锈病和黄矮病等具有一定的免疫效果。

此外，冰草属植物具有分蘖、小穗比较多的优点，因而具有高产的特性[23]。

研究显示，冰草属属于P基因组。

阎贵兴等对冰草核型研究表明，冰草属植物中除沙芦草是二倍体外，其余的冰草属植物，如扁穗冰草、沙生冰草等大多数均为四倍体植物[24]。

1.6拟鹅观草属[Pseudoroegneria（Nevski）A．Love]

拟鹅观草属[Pseudoroegneria（Nevski）A．Love]，是由Love[25]根据其染色体组成而新建的一个禾本科小麦族多年生草本的小属，大约只有15-20个种。

拟鹅观草属属于St基因组，以Pseudoroegneriastrigosa（M.Bieb.）A.Love作为模式种，具有二倍体和四倍体两种基因型[26]，主要分布在东亚西部、中亚、高加索、北美西部以及中东等地区[27]。

Dewey等[28]研究显示，小麦族一半以上物种的染色体组是St基因组形成了一些多倍体物种，如偃麦草属（ElytrigiaDesv．）、鹅观草属（RoegneriaC．Koch．）、猬草属（HystrixMoench）等。

另外，St染色体组具有抗逆和抗病特征[29]，可用于小麦作物育种，以此来改善小麦性状，因此对St染色体组的研究显得极为重要。

1.6大麦属（HordeumL.）

大麦属（HordeumL.）是禾本科小麦族的一个属，该属均一年生或多年生草本，大约30余种，其模式物种是大麦（Hordeumvulgare）。

大麦属分布于全球温带或亚热带的山地（高原）地区，在新旧大陆各有10多种，中国连同栽培种约15种（包括变种）[30]。

该属中部分是粮食作物但多为优良牧草。

1.7偃麦草属（LophyrumLove）

偃麦草属（Elytrigia）又可称速生草，或者匍匐冰草，它是禾本科小麦族多年生草本植物，具长而且非常发达的地下横根茎[31]，具有生长势强、再生性很好的特点。

该属大约有50种，分布于全世界温寒地带，我国共有6种，在华北、西北和新疆等区域，其他地区有栽培，可作为饲料。

该属物种具有抗寒、抗旱、抗病虫害和耐盐碱等优点[32]，因此可作为小麦远缘杂交的亲本材料。

偃麦草属多是优良牧草，加上它能耐旱，并且适合生长于沙质土壤，所以常被我国内蒙古、新疆、青海等省（自治区）用来防风固沙[33]。

并且，目前已经筛选出部分优良耐盐的材料，对盐渍化土地的治理与改善具有重要意义[34]。

偃麦草属植物被确认为是基于E染色体组的基础上形成的一年生和多年生物种，可分为二倍体、四倍体、六倍体或者十倍体植物。

偃麦草属植物里，在小麦育种中最为成功并且最具有利用价值的是六倍体的中间偃麦草[35]。

中间偃麦草的染色体组已经被确定了，是EbEeSt或JsJSt[36]。

2分子标记

分子标记以生物遗传物质核酸的多态性为基础，通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的一门技术。

DNA分子变异的方法主要有随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、简单序列重复标记（SSR）、扩展片段长度多态性标记（AFLP）、重复序列之间长度多态性标记（IssR）、限制性片段长度多态性标记（RFLP）等[37]。

2.1分子标记的种类

2.1.1基于PCR技术的分子标记技术

基于PCR技术的分子标记技术可分为单引物扩增和双引物扩增两类。

其中，单引物扩增又可分为随机扩增多态DNA（RAPD）、DNA扩增指纹（DAF）任意引物PR（AP-PCR）单引物扩增反应（SPAR）、序列特异扩增区（SCAR）等；双引物扩增包括扩增片段长度多态性（AFLP），STS（Sequence-1aggedSites），SCAR（Sequence．characterizedAmplifiedRegions）[38]。

RAPD技术是由Williams[39]等人在1990年发展起来的，是通过聚合酶链式反应来实现分子标记的新技术。

其主要原理是以基因组DNA为模板，运用一个随机寡核苷酸序列作为引物进行PCR扩增，进而揭示DNA序列的多态性。

RAPD技术具有程序简单、容易操作、DNA用量少、没有放射性、周期短等优点，在远缘杂交后代外源遗传物质检测、基因标记与定位和遗传多样性分析[40—41]等方面得到了广泛应用。

但RAPD技术存在一些缺点，如重复性较差，成本较高等。

2.1.2基于重复序列为基础的分子标记

卫星DNA（microsatelliteDNA）或短串联重复（shorttandemrepeat,STR）,是一种以1～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，两侧的序列较为保守和专一，分布整个基因组的各个位置上[42]。

SSR标记是利用SSR序列两侧的序列设计双引物对重复区域进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测扩增片段的多态性的分子遗传标记[43]。

微卫星序列广泛存在于真核生物的基因组中，每隔l0～50bp左右就会有一个，由于重复的次数和重复的程度不完全一样，所以每一个位点有多态性[44.45]。

该标记在基因标记与定位、遗传图谱构建和品种指纹作图构建等方面得到迅速而且广泛的应用。

2.1.3基于Southem杂交技术的分子标记

RFLP是基于Southem杂交技术的分子标记，利用限制性内切酶切割生物体基因组DNA而产生的长短、种类、数目不同的限制性片段，这些具有差异性的DNA片段通过已克隆，标记的DNA片段作为探针然后进行Southern杂交，最后用放射自显影或非同位素来检测DNA的多态性[46]。

2.1.4其它新的分子标记

单核苷酸多态性（SNPs），用于检测基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A，T，G，C）的替换而引起的多态性。

IFLP（IntronFragmentLengthPolymorphism），CAPs（CleavedAmplifiedPolymorphicSequence），SSCP（Single．StrandConformationPolymorphism）

2.2分子标记的特点

分子标记具有如下优点：

（1）不受生物体发育季节、时期、环境的限制，不存在是否表达问题；

（2）数量很多，可遍布整个基因组；（3）它的多态性高；（4）也不影响目标性状的表达，不与不良性状连锁；（5）许多分子标记表现为共显性，它能鉴别出纯合体和杂合体的基因型，并且可以提供完整的遗传信息。

目前广泛应用的分子标记有RFLP、RAPD，AFLP、SSR、SCAR等[47]。

分子标记优缺点的比较

种类

名称

优点

缺点

PCR

RAPD、DAF、AP-PCR

操作方便、自动化程度高

稳定性差

AFLP、STS、SCAR

共显性，多态性高、稳定性高、重复性好、速度快、自动化程度高。

步骤繁琐，对模板反应迟钝，成本高。

重复序列

ISSR、SSR

多态性高、稳定性强、技术要求不高、成本低廉。

需要大量的人力物力和时间。

Southem

RFLP

技术稳定、重复性好、无表性效应、等位基因之间共显性、非等位基因之间不存在上位效应、标记数量多。

费用高、工作量大、DNA含量和纯度要求高、操作繁琐、技术难度高、污染大、有放射性危害。

2.3分子标记的作用

2.3.1亲缘关系鉴定与分类研究

分子标记技术可用近缘属之间、种之间、亚种之间以及不同染色体之间的鉴定分析。

丁春邦等用RAPD分子标记来探讨拟鹅观草属的8种1亚种和鹅观草属的7种植物的种间关系。

结果表明，各物种间遗传差异性非常明显，并且具有非常丰富的遗传多样性；RAPD分子标记可以分开拟鹅观草属的各个物种，同时可以将形态相似的地理分布相同或相近的物种聚类起来；并且这些结果与细胞学和形态学的分析结果相符合[48]。

周永红等也利用RAPD来分析过鹅观草属、披碱草属、猬草属和仲彬草属植物之间的亲缘关系[49]。

2.3.2品种鉴定与分类

长期以来，各种果树、药用植物以及一些农作物等，因为不同地域间相互引种，从而出现了许多同物种在不同的地方异名或者同一个名字但是是不同事物的现象，导致品种名和品种分类比较混乱。

因而如何对品种进行准确的鉴定和分析，成为基因工作者共同的难题。

目前，国内外常常采用分子标记来解决这一难题。

周永红等采用RAPD标记研究赖草属植物。

结果显示，东北猬草具有Ns染色体组，而不是St和H基因组，从而证明其为赖草属植物。

2.3.3分子遗传图谱的构建.

遗传图谱又名连锁图谱，可以用来反映基因或者其它遗传标记在染色体上的排列顺序和间距。

遗传图谱的构建是遗传学研究中的一个非常重要的领域，特别是分子遗传图谱的构建，是从分子水平上进行育种的重要的可靠地依据。

自1980年Bostein第一次提出用RFLP标记构建遗传图谱以来，分子标记构建遗传图谱得到迅猛发展，至今各种主要作物的RFLP图谱已基本构建完成，但小麦分子标记图谱的构建发展相对比较慢，仅有两套较为齐全。

一套是英国剑桥实验室绘制的，图谱标记有500多个，平均每条染色体上就有25个；另一套是美国康耐尔大学和法国等合作绘制的，标记数多达850多个[50]。

2.3.4遗传多样性研究

遗传多样性研究是生物种质资源研究的主要内容，能比较全面地了解现有种质资源的遗传多样性，从而减少在育种工作中筛选配的盲目性，最终提高我们的育种效率。

2.3.5性状基因的定位及克隆

在育种中，由于生物性状基因有质量性状和数量性状基因，而质量性状又有显、隐性性状，我们通过表型是无法识别目的基因究竟是纯合的还是是杂合的。

分子标记技术就可以对其进行分解，对控制数量性状的基因像对控制质量性状的基因一样，同时多个基因进行研究。

比如，在小麦基因定位中，应用较多的是遗传连锁交换定位法［52]和非整倍体分析定位法[53]。

通过选择两个在目标性状上有差异的群体，来确定它和目标基因是不是连锁以及他们连锁的紧密程度[54]。

2.3.6分子标记辅助选择

在作物育种中通常要把有用的外源基因引入我们的栽培种中，然而对外源基因是否成功转入栽培种，靠传统的方法检测往往需要较长的时间，而用分子标记的方法辅助育种选择，则不受其它环境因素，时间和基因效应的影响，并且结果也可靠，同时可在低世代或者苗期进行选择，最终加快回交速度，加快有利基因的导入，从而大大缩短了育种周期[55]。

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