胶体金使用问答.docx

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胶体金使用问答

食品安全快速检测试剂盒

1、问：

食品安全速检测试纸的优势是什么？

答：

1、检测速度快、且具有一定的灵敏度和转移性

   2、结构简单、携带方便，非常适合现场快速检测

   3、操作简单，使用者不需专门培训就能掌握

   4、价格便宜，不需要检修维护，一次性使用。

   目前试纸法已广泛应用于食品、水质、医疗卫生等各个领域。

2、问：

食品安全快速检测试剂盒的检测方法是什么？

答：

食品安全快速检测试剂盒采用的检测方法来源于国际法、教科书中经典的分析方法以及最新的科研成果，并结合现场条件进行简化和改良。

检测的灵敏度、稳定性、可靠性均达到食品卫生评价标准的要求。

已研发出包括甲醛速测试剂盒、二氧化硫速测试剂盒、亚硝酸盐速测试剂盒、蛋白质速测试剂盒、苏丹红速测试剂盒等在内的60多种速测试剂盒。

5、问：

胶体金检测卡的优势是什么？

答：

1、方便快速、所有反应能在15分钟内完成

   2、成本低、不需要特殊的仪器设备

   3、应用范围广，可适应多种检测条件

   4、准确、假阳性率低

   5、标记物稳定，标记样品在4℃贮存一年以上，无信号衰减现象。

   6、胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，对人体无毒害。

一般企业会用自己检测与外部有资质的结构测试相结合，因为样品数量巨大，如果均外部测试，意识费用非常高，二是送样、检测、获得结果的周期长，效率低，无法满足实际应用的需求，所以自检也是顺应企业高效节约的宗旨，对自己用检测出值得怀疑的样本再送检测机构检测

胶体金快速检测卡使用中常出现问题

胶体金快速检测卡使用中常出现问题

常见问题/异常情况

原因分析

建议处理方案

样品层析速度异常慢无样本跑动（在检测窗内不见有液体在膜上流动）

1.   加样量太少（一般要求加样为40-80ul）。

2.   样本过于粘稠或有沉淀物（如血块）。

3.   该测试条已受潮失效。

1.   增加加液量或滴加少量辅助液

2.   滴加少理辅助液，对样本进行预处理以去除沉淀物（血清/血浆离心后使用，全血重新取样）

3.   更换新测试条重新检测，测试条尽量现拆现用

检测窗内出现红/紫色坚线

该试纸条受轻微的物理损伤

该情况不影响检测结果，可在背景清晰后于规定时间内读取结果，或更换新测试条重新检测

有大量全血溢出，NC膜表面偏红，影响结果判读

1.   该测试条NC膜严重受损（机械损伤）或断裂

2.   使用已溶血的全血标本

1.   更换新测试条重新检测。

2.   尽量使用新鲜全血进行检测

层析时无红/紫红色背景出现

该测试条已受潮失效

更换新测试条重新检测

漏检率偏高（假阴性）

1.   检测时间太短

2.   加样量太少，辅助液滴加过量，样本被稀释

3.   样本中被检物浓度太低

4.   个别样本中含有较为特殊物质或亚型

5.   该测试条受潮，活性下降或失活

1.   按说明书要求正确判读（建议对于较弱阳性或阴性标本至少10-15分钟判读结果

2.   按说明书要求正确加样或辅助液

3.   采用其它检测方法进行确认

4.   更换新测试条重新检测，测试条尽量现拆现用

检测线/对照线不完整

该试剂条有轻微的物理损伤

该情况不影响检测结果，也可更换新测试条重新检测

检测线与对照线之间出现灰暗的阴影

测试条NC膜表面的透明胶带边沿引起的视觉差异

该情况不影响检测结果，可在规定时间内读取结果

检测后出现假阳性结果

1.   该测试条灵敏度偏高

2.   该样本含特殊干扰物或已被污染

3.   在规定的时间后判读结果

1.   提前判读结果或更换新测试条重新检测

2.   用其他检测方法确诊检测结果，确保样本不受污染

3.   按说明书要求正确判读结果，30分名钟后检测结果可能不准确

呈色检测线比对照线明显深黑

强阳性结果

正常情况，不影响检测结果

检测线或对照相馆线附近出现白斑或白色条带

个别情况，NC膜自身质量原因，生产无法控制

该情况一般不影响检测结果

同一样本血清检出时间快于全血标本

相同体积的血清标本含受检物的量要高于全血标本

正常情况，不影响检测结果

NC膜表面颜色较深（紫红甚至偏紫）

测试刚开始该现象明显，3-5分钟后颜色就会明显褪去属正常现象

正常情况，不影响检测结果

ELISA检测试剂盒使用指南

步骤

常见问题

解决方案

实验准备

1加样器不准确；尤其10ul以下的加样器，对结果影响极大；

2保温设备不良；

3洗涤用水不规范。

1校正加样器；10ul以下加样器最好采用进口产品（芬兰、法国等）；

2仔细校正温度到37℃，水浴箱为佳；

3必须使用去离子水或蒸馏水，不得用自来水、矿泉水等。

4认真阅读使用说明书。

样品加样

1加样不准确；

2没有混匀。

1加样时一定要仔细。

加样后，再检查，以防漏加、错加。

2加样后，反复抽吸3次混匀，防止血清聚集孔底，导致非特异性吸附。

洗涤

洗涤不彻底

1每次注水洗涤，应静止30秒钟；

2选用吸水纸作为衬垫，每次洗涤后扣干孔内水分；

3可选用塑料洗涤瓶。

加酶反应

漏加

滴加后，认真检查各孔

结果判断

1包括阴性对照孔在内，各孔显色普遍偏深；

2包括阳性对照在内，各孔均无显色；

3阳性对照不显色，而其它样本显色正常；

4有些标本显色不深，判断阳性困难。

1可能是洗涤不充分；加样过量；温育时间过长温度过高；按说明书重新操作。

如无改善，可与生产厂家联系；

2可能是漏加样本或酶液；温育时间过短温度过低；试剂保存不当活性下降；按说明书重新操作。

如无改善，可与生产厂家联系；

3阳性对照漏加、错加或失效。

重新操作。

如无改善，可与厂家联系，索要对照品；

4重新操作。

最好使用酶标仪，测定光吸收度，按P/N值标准判断。

试剂保存

保存不规范

一定要在2-8℃存放。

不得过高，也不得冻存（冻存后，酶液将失效）。

对照品

对照品为冻干品

按对照管标示，加入相应体积的去离子水或蒸馏水复溶，充分溶解混匀。

可按说明书使用。

ELISA试剂盒常见问题

ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：

①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。

1．样品稀释 

酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2．试剂盒平衡 

试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。

平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。

冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。

3．样品和试剂的混匀 

稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4．加样 

在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。

注意的关键点是：

加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。

加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。

溅出会对邻近孔产生污染。

出现气泡则反应液界面有差异。

所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

5．温育 

温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。

ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。

温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。

最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。

一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。

因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。

6．洗板 

固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。

洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。

洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。

7．边缘效应 

使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。

经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。

聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。

因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

8．显色 

显色一定要控制时间,根据试剂盒说明操作即可。

一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。

9．比色 

比色要注意波长的选择。

以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。

因此，容易出现滤光片错用的问题。

其次，单波长或双波长比色选择的问题。

所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。

最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。

因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。

由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。

综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。

为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。

操作过程中可能出现的问题和解决方法

问题 可能原因 解决方法 显色淡，灵敏度偏低1、试剂盒在运输途中时间太长，温度太高尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温2、试剂盒未充分平衡试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。

3、培养箱温度不足37℃注意培养箱温度，放入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定，非隔水式培养箱尤其应注意4、保温时间不足校正定时钟准确定时5、洗涤时冲击力太大、浸泡时间过长、洗涤次数增加按说明书要求保留洗涤时间，准确记住洗涤次数6、移液器吸液量不足，吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密，吸嘴内壁要清洁，最好一次性使用7、蒸馏水水质有问题使用新鲜合格的蒸馏水8、底物作用时间不足准确定时背景深，全部呈有色,1、洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留浓缩洗液准确配制；10倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释；充分洗涤，彻底拍干。

加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染2、样品污染样品应新鲜采集，或低温保存，防止污染3、培养箱温度超过37℃或反应时间过长调整培养箱温度，准确定时4、吸嘴重复使用，未洗净或消毒不彻底吸嘴尽可能一次性使用5、蒸馏水被污染使用新鲜蒸馏水6、酶等试剂混用不同批号试剂勿混用7、一次实验的标本量过多，加样时间太长，导致实际反应时间延长合理安排实验，避免几块酶标板同时加样重复性不佳1、样品数量多少不一，加样时间有长有短重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近2、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性3、加样量不一致样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴出现白板，阳性对照不显色显色液变质更换新的显色液洗涤液配制有误请按说明书所示稀释倍数配制未加酶结合物而认为已加入注意不要漏加终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用每次加液前均应看清标签

ELISA实验操作中常见问题分析

    由于ELISA（酶联免疫试验）具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。

虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。

优质的 试剂 ，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。

如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。

尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。

现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。

    1 标本及采集、贮运因素

严重溶血 ，以HRP为标记的ELISA测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性； 混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有 细菌污染 ，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应； 标本凝固不全 ，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果； 采血试管洗涤不彻底 、反复使用易交叉污染； 塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。

    血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。

一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合，使间接法的 试剂 本底加深。

超过一周测定的需－20℃保存。

冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。

混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

反复冻融会使 抗体 效价跌落，所以测 抗体 的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

2、试剂的影响

    ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。

由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应 试剂 盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类 试剂 盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。

也有厂家坚持 试剂 盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。

基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂 盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV特异性抗原。

第三代 试剂 的敏感度大大提高了。

基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下：

    基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵母 菌为表达系统。

该类抗原与合成肽相比具有以下特点：

a.分子量大。

合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。

b.稳定性好。

包被的抗原的稳定性可使 试剂 盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的 试剂 盒效期只有3-4个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。

c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高 试剂 盒的灵敏度，提高检出率。

d.纯化难度大。

基因工程抗原的纯化技术难度较大。

    合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。

合成肽抗原有以下特点：

a.分子量太小；b.一般只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳定性差。

    国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。

有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。

使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。

因此。

选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

• 选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据。

• 要注意试剂的批号和出厂日期，虽然试剂的有效期多为1年。

最好选择刚出厂的试剂使用。

不同厂家的试剂不能混用。

    不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。

例如：

在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。

除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。

单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。

3、操作技术的影响

操作过程的控制：

⑴严格按照试剂说明书进行操作。

操作前将试剂在室温下平衡30～60min。

⑵加样后及时放人孵箱。

标本较多时，要分批操作。

按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

（3）封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。

（4）用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干：

还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。

（5）合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。

（6）加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

（7）显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。

（8）加样时保持显色剂不外流；A、B液应避免接触金属器械。

加终止液时应避免产生气泡。

（9）应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。

以上的措施可以使“花板”降至最低限度。

从而提高检测的特异性。

并得到更准确、可靠的实验结果。

    加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。

由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。

建议用一次性吸嘴。

加样器也要经常清洗，定期校准。

加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

    温浴影响，在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原 抗体 反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。

为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。

应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。

由于公司的试剂 盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。

另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。

96孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。

    洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。

ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。

通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。

聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。

可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

    洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，各种 试剂 盒的洗液不要混用。

聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。

洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。

洗液需要稀释，应按要求稀释。

配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水，电导率小于1.5μs/cm，洗液如果结晶应待其融解后配制。

手洗条件一致性较差，对结果影响较大，防止洗液在孔内形成气泡。

半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。

    保证洗板浸泡时间为40秒左右，孔内液体被洗板机吸得越干净洗涤效果更好，手工洗板

4.显色和比色

    TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。

TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。

这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。

此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。

酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。

酶标仪的主要性能指标有：

测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。

优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。

酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪