λ噬菌体概论.docx
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λ噬菌体概论
λ噬菌体裂解途径和
溶原化途径的选择和调控
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目录
摘要
1、
λ噬菌体的发现历史
二、λ噬菌体分子生物学概述
（1）基本概念
（2）λ噬菌体基因组的结构
（3）λ噬菌体的复制
三、λ噬菌体载体的构建及其主要类型
（1）构建λ噬菌体载体的基本原理
（2）λ噬菌体载体的主要类型
四、λ重组体DNA分子的体外包装
（1）λ重组体DNA分子的转染作用
（2）λDNA的体外包装
（3）λ噬菌体DNA的包装限制问题
5、
噬菌体生活周期
（1）噬菌体生长的测定
（2）毒性噬菌体
（3）
溶原性噬菌体和溶原性
6、
λ噬菌体的溶原途径和溶菌途径
7、
两种途径共同的早期基因表达途径
8、
裂解途径的建立及基因调控
（1）
裂解途径的建立
（2）
基因调控
（3）
）反终止作用
9、
溶原化途径的维持
（1）CI蛋白功能
（2）CI蛋白的结构
（3）阻遏物与DNA的结合及调控机制
十、溶原化和裂解周期的平衡
总结
参考文献
λ噬菌体的裂解途径和溶原化途径的选择和调控
摘要:
大约40年前，巴黎巴斯德研究所的AndRELwoff和他的同事发现，当用中等剂量的紫外线照射一株普通大肠杆菌时，细菌停止生长，大约90min后，这些细菌裂解，大量的被称为λ的病毒被释放到培养基中。
释放的λ噬菌体通过感染新细菌扩增。
许多被感染的细菌不久裂解，产生新的噬菌体，但是有些细菌存活下来并且携带潜伏状态的λ噬菌体。
这些细菌正常的生长和分裂，直到培养物又一次被照射，然后这些子代细菌像起始的细菌一样，裂解并产生大量新的λ噬菌体。
AndRELwoff和他的同事意识到病毒两种状态的转变——裂解状态和溶原化状态，这昭示了一个基本的生物过程：
基因的打开和关闭即基因调控。
本文旨在以λ噬菌体为例，简介λ噬菌体并从分子水平上阐明裂解途径和溶原化途径的基因调控机制。
关键词:
λ噬菌体基因调控裂解途径溶原化途径
Abstract：
40yearsago,AndreLwoffandhisco-workers,inthePasteurInstituteof
Paris,foundthatageneralstrainofE.colistoppedgrowingaftershinedbymediumUV,lysingandreleasingalotofvirusescalledλ90minuteslater.ThenthereleasedλphagesamplifiedbyinfectingnewE.coli.AndmanyinfectedE.colilysedsoon,generatingnewphages,whilesomeE.colisurvivedandcarrieddelitescentphages.TheseE.coligrewandseparatednormallyuntiltheywereshinedbyUV,thentheylysedandgeneratedamountsofnewλphageslikethebeginningE.coli.AndreLwoffandhisco-workersrealizedthetwostatesofλphage——lyticandlysogenic,andthisimpliedacommonbioprocess：
openandcloseofthegenenamelygeneregulation.Inthisarticle,Iwillintroduceλbacteriophageandprovidethegeneregulationmechanismoftheswitchingbetweenthelyticpathwayandlysogenicpathway.
Keywords：
λbacteriophage,generegulation,lyticpathway,lysogenicpathway
λ噬菌体是一种感染大肠杆菌的温和噬菌体，侵染E.coli后既能进行复制和造成细菌裂解死亡，又能整合进入E.coli基因组并随着宿主基因组进行复制，进行溶原态生存。
溶原发育尽管十分稳定，但是仍然可以通过一些损害宿主细胞的诱导剂使之诱导进入裂解感染。
λ噬菌体的裂解发育、溶原发育和溶原发育到裂解发育的诱导是研究生物分子调节优异的模型。
经过四十多年的研究，在这个模型中已经发现了众多的正调节因子和负调节因子在转录水平或转录后调节基因的表达。
λ噬菌体的遗传背景，生活周期都已研究得比较清楚，特别是有关调控，可以说是集原核生物调控之大成，几乎各种调节途径在λ噬菌体中都存在。
在基因工程中，λ噬菌体经改装后又常用作转染的载体，因此掌握λ噬菌体的遗传背景及调控机制是十分重要的。
一、λ噬菌体的发现历史
1951年J.Lederberg的妻子EstherLederberg证明了J.Lederberg和Tatum用来杂交的K12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。
在E.coliK12中是有原噬菌体的存在。
Jacob和Wollman（1956年）发现了合子诱导（zygoticinduction）现象，并利用合子诱导确定了几个E.coli染色体上原噬菌体的整合位点。
他们发现Hfr（λ）×F－所得到的重组子频率要比Hfr×F－（λ）或Hfr（λ）×F－（λ）要低得多。
这是由于在Hfr（λ）×F－的杂交中，原噬菌体进入无阻遏物的受体细胞质中，进行大量复制使受体细胞裂解，因此不易得到重组子，此现象就称为合子诱导。
现在我们再回过头来查阅一下传递等级作图，中断杂交实验以及重组作图都是采用Hfr×F－（λ）就是不致产生合子诱导的缘故。
二、λ噬菌体分子生物学概述
1．基本概念
λ噬菌体的调控有多种形式，有正调节、负调节、自主性的反馈调节、抗终止调节、反义调节及反向调节等。
其机制之精巧，过程之复杂，形式之多样堪为集原核生物调控之大成。
CI蛋白是λ噬菌体的阻遏蛋白，由两个亚基组成，每个亚基都有两个功能区，N端与操纵基因结合，C端具有相互结合成二聚体的能力。
CI蛋白的二聚体与二聚体之间有协同效应。
Cro蛋白也是一种阻遏蛋白，以二聚体的形式与操纵基因结合，但Cro最易和OR3结合，而CI最容易与OR1，OR2结合，Cro无协同效应。
CⅡ蛋白能激活cI的建立溶原化启动子PRE，整合酶启动子PI以及反终止蛋白Q的反义RNA动子PAQ，这些启动子的激活却对溶原化有利。
λ噬菌体也具有反义的mRNA调节的机制。
一是PRE启动子其转录方向与cro基因的转录方向相反，其5′端和cro基因的mRNA重叠，可进行反义抑制cro的表达；二是PAQ启动子转录一段长约200b的RNA，不编码蛋白，而和抗终止蛋白Q的mRNA5′端互补，起到反义抑制的作用。
λ噬菌体有2个抗终止基因N和Q，它们的产物可在一定的位置和RNA聚合酶结合，使其顺利通过早早期和晚早期转录的终止子，有利于宿主的裂解。
反向调节是λ噬菌体所特有的，此是利用不同启动子PL和PI所产生的RNA，虽序列重叠，但长度不同，形成二级结构也不同，前者的mRNA易被RNaseⅢ剪切，继而被核酸酶所降解，从而不能表达，而只有PI启动子转录的intmRNA才是稳定的可以翻译成整合酶，供溶原化时λ基因组插入到宿主染色体上所需。
2．λ噬菌体基因组的结构
λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。
其分子量为31×106dal，是一种中等大小的温和噬菌体。
迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，基因组长达50Kb，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。
λ噬菌体的61个基因中有38个（图1）较为重要。
其生活史可分为裂解周期和溶原周期。
细菌处于溶原化状态时，细胞质中有一些λCI基因的产物CI蛋白,这是一种阻遏蛋白，
可以阻止λ左、右两个早期起动子的转录，使之不能产生一些复制及细胞裂解的蛋白。
λ的DNA随着宿主的染色体复制而复制。
但在UV诱导下Rec蛋白可降解CI蛋白，诱导90％的细胞裂解。
有时λ也可自发地从宿主的染色体上游离出来，进行复制，最终导致宿主细胞的裂解，此称为治愈（curing）。
游离在细胞质中的λ可以进行滚环复制，产生多个拷贝，并合成头部和尾部蛋白，包装成完整的λ噬菌体，使细胞裂解，释放出λ噬菌体再感染新的细胞。
因为λ噬菌体的DNA也有整合在染色体上和游离于细胞质中两种状态，所以也称做附加体。
但和F因子不同，λ噬菌体有细胞外形式，而F因子无细胞外形式。
在λ噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。
注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。
随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。
这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（略语cos，系英语cohesive-endsite的缩写，即粘性末端位点之意）（图2）。
在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48502碱基对。
图1λ噬菌体的基因组（转引自Russell,1992）
图2λ噬菌体DNA分子环化作用
3．λ噬菌体的复制
λ噬菌体的复制区共有两个区域。
一个是连续的4个O蛋白结合位点，每个位点18bp长；邻接另一个区域是A－T丰富区，长40bp。
λ在Ori近上游处的复制起始是需要从PR开始的转录链的“激活”，如OriC一样，并不需要RNA为前导链提供引物。
和这个系统相似，表明RNA的合成可能涉及到起动起始区某些结构的改变。
λ噬菌体O和P基因的产物是复制起始所必须的。
O蛋白结合到λ的Ori，而P蛋白和O蛋白相互作用。
还和细菌的蛋白相互作用。
Ori区域位于O基因中，因此O蛋白的作用紧靠其合成位点。
λ的变异体称作λdv，它含有较短的基因组，携带所有的复制所需的信息，但失去了感染的功能；在E.coli中得以存活的λdvDNA是作为一种质粒。
这种λdvDNA也能通过一个含有噬菌体编码的O和P蛋白以及细菌复制的系统进行体外复制。
λ蛋白O和P形成一个复合物在λ的Oriλ上和DnaB结合在一起。
起始的第一步是O结合成一个粗链的直径为11nm的结构，称为O－体（O-some），此O体含约100bpDNA（这段DNA的分子量为60KDa），其中有4个长18bp的O蛋白结合位点，分子量为34Kd。
每个位点都有一个回文顺序（TCCC－GGGA），这样就能结合对称的O二聚体。
但每个位点的顺序不完全相同，当O的量较少时，优先和Ⅱ、Ⅲ结合。
O结合位点的序列呈弯曲状，当结合O蛋白后便进一步弯曲。
若DNA是超螺旋的话，O蛋白的结合会导致Ori区结构的改变。
A·T丰富区就连接在O－结合位点的边上，成为S1酶的敏感位点。
S1酶是特异性识别单链DNA。
表明解链反应就发生在O蛋白复合体的边上。
O蛋白的作用是和OriC上的DnaA相似。
它为DnaB的结合作为准备。
λ具有特有的P蛋白，相当于DnaC的功能，导致DnaB和Ori区结合。
当λ的P蛋白和细菌的DnaB结合形成一个大而对称的复合体，它含有较多的DNA（总量为160bp）。
λ的P蛋白有一个特殊的作用，就是可以抑制DnaB的解旋酶活性。
P从复合体中释放出来时就触动了复制叉的移动，随之引发复制，DNA开始合成。
有的蛋白对复制来说是必要的，但没有直接涉及DNA的合成。
一个有趣的例子就是DnaK和DnaJ蛋白。
DnaK是一个分子伴侣（chaperone），它和真核的应激蛋白（stressprotein）相关。
它和其它蛋白相互作用，以构象依赖（conformationdependent）方式在很多细胞活性方面发挥作用。
DnaK/DnaJ的作用可能是分解前引发复合体（preprimingcomplex），导致P的释放，随之开始复制。
表11－5已表示了在OriC和Oriλ在起始复制中的相似性。
它们涉及的阶段相同，依赖重复的元件。
第一步是蛋白识别Ori，和DNA结合形成复合体。
DnaA识别OriC，O蛋白识别Oriλ，短的A·T丰富区被解链。
然后DnaB被装配上，在OriC和Oriλ上需要不同功能的蛋白，在此阶段，对于别的Ori区，还需要其它的蛋白。
当解旋酶加入到复合体中时，复制叉就产生了。
复制开始后RNA的引物最终产生了。
用OriC和Oriλ提供了复制起始激活的一般模型。
在哺乳动物细胞中的病毒SY40复制起始也是相似的。
三、λ噬菌体载体的构建及其主要类型
（1）构建λ噬菌体载体的基本原理
利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。
现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：
①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。
这是因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。
②在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。
由此可构建出两类λ噬菌体作载体：
一类是插入型载体（insertionvectors）（图3），可将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；
图3λ噬菌体的插入型载体
图4λ噬菌体替换型载体
图5 野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱
另一类是转换型载体（rePlacementvectors），即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。
（图4、图5）
插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于78%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。
所以λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。
但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。
粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。
所以粘粒主要用于DNA文库的构建。
（2）λ噬菌体载体的主要类型
（i）插入型载体
外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。
插入型的λ载体又可以分为免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE．coliβ-galactosidase）两种亚型。
①免疫功能失活的插入型载体：
在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。
当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶原周期。
因此，凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。
②β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：
它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着β半乳糖着酶基因lacZ。
由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。
如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成β-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。
（ii）替换型载体
替换型载体又叫做取代型载体（substitutionvector），是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
λNM781便是其中的一个代表。
在这个替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因）,由于这种λNM781噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了，能在乳糖麦康基氏（MacConkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。
如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。
用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：
第一，应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的DNA区段。
第二，将上述所得的人DNA臂同外源DNA片段连接。
第三，对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。
四、λ重组体DNA分子的体外包装
（1）λ重组体DNA分子的转染作用
用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。
这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染（transfection），它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导（kransduction）。
λDNA的转染作用，是一种低效的过程。
即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的λDNA，其典型的转染效率（即每微克λDNA转染产生的噬菌斑数目），也仅为105～106之间。
体外连接的结果，转染效率便下降到了104～103左右。
（2）λDNA的体外包装
λDNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。
根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。
头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。
将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。
这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理（图6）。
图6T4噬菌体的体外包装
（3）λ噬菌体DNA的包装限制问题
λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。
上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75％。
按野生型λDNA分子长度为48kb计算，λ噬菌体的包装上限是51kb。
编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。
5、噬菌体生活周期
（1）噬菌体生长的测定
噬菌体生长的测定——一步生长曲线噬菌体繁殖和其他病毒一样，其生活周期包括吸附，侵入，复制，组装和释放5个阶段。
一步生长曲线定量描述毒性噬菌体生长规律的实验曲线称为一步生长曲线。
该曲线可以用来反映每种噬菌体的3个重要的特性（潜伏期、裂解期、裂解量）参数。
一步生长曲线的实验方法如下：
先把在对数期生长的敏感细菌悬浮液与适量的噬菌体混合，通常细菌与噬菌体的混合比例为10：
1，避免几个噬菌体同时侵染一个细菌细胞。
经数
分钟吸附后，混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清，以中和尚未吸附的噬菌体。
然后再用培养液进行高倍稀释，以免发生第二次吸附和感染。
培养后定时取样，将含噬菌体的样品与敏感细菌混合，在乎板上培养，计算噬菌斑数。
结果可见，在吸附后的开始一段时间内（5-10min），噬菌斑数不见增加，说明噬菌体尚未完成复制和组装，这段时期称为噬菌体的潜伏期。
紧接在潜伏期后的一段时间（感染后20—30min），平板中的噬菌斑数突然直线上升，表示噬菌体己从寄主细胞中裂解释放了，这段时间称为裂解期。
每个被感染细菌释放新的噬菌体的平均数称为裂解量（图7）。
当宿主全部裂解，溶液中的噬菌体的效价达到最高点时称为平稳期。
裂解量=裂解期平均噬菌斑数/潜伏期平均噬菌斑数
图7T4噬菌体的一步生长曲线
（周德庆，微生物学教程，1993）
（2）毒性噬菌体
通常把毒性噬菌体看做为噬菌体的正常表现。
大肠杆菌T4噬菌体是一种毒性噬菌体，它是双链DNA病毒，由二十面体的头部和一个可收缩的尾部组成，尾部由中空的尾髓和可收缩的蛋白质尾鞘组成，尾端有6根尾丝（图8）。
毒性噬菌体入侵宿主可分为五个阶段（图9）。
图8大肠杆菌（E.coli）T4噬菌体的结构示意图
A.T4噬菌体的电镜图像B噬菌体各部分名称
（L.M.PrescottMicrobiology，1999）
图9-1T4噬菌体的侵染复制过程
图9-2T4噬菌体的侵染复制过程
一个噬菌体典型的生活周期，从噬菌体在细菌细胞表面的特异受体吸附开始，随后遗传物质注入宿主。
细菌含有降解外源DNA的限制修饰系统，许多侵染是不成功的。
接着核酸复制开始，噬菌体基因编码的酶被合成。
最后，合成噬菌体衣壳蛋白，装配成新的噬菌体外壳，同时包装一个拷贝的基因。
然后，噬菌体释放，普遍通过裂解进入周围培养基。
也即经过吸附，侵入，复制，组装和释放5个阶段。
吸附（附着）（adsorption，attachment）。
噬菌体侵染宿主通过附着在细胞表面的特异受体上。
受体的性质不同，是蛋白质或多糖，它们可在任何时间存在细胞表面或只在某些条件下产生。
T4噬菌体结合在大肠杆菌外膜的脂蛋白上（T2、T4、T7、的吸附位点是脂多糖，T2、T6的吸附位点是脂蛋白），而l噬菌体只有当细菌在含有麦芽糖的培养基上生长时，才能结合在外膜的麦芽糖转运蛋白上。
侵入（Pentration）。
一般只有遗传物质注射进入宿主，留下空蛋白外壳在细胞表面。
在噬菌体头部的溶菌酶溶解宿主细胞壁肽聚糖。
噬菌体侵入方式视噬菌体结构而定。
在T4噬菌体的例子中，T4噬菌体有高度复合结构的收缩性尾，噬菌体通过长的尾丝吸附和基板接触细胞壁之后，尾鞘收缩DNA注入细胞。
多数情况进来的DNA可以被内切核酸酶降解，它们是宿主的部分限制修复防御系统，偶然噬菌体的DNA可以存活引起侵染。
此防御内切核酸酶称为限制酶，结合在外源DNA的特异序列，并在此位点切离DNA。
微生物自己的DNA通常通过甲基化被修饰，阻止这些限制酶降解。
某些噬菌体如T偶数噬菌体有包括糖基化作用或甲基化作用和修饰自己DNA的机制，阻止它们在注射时被限制酶降解。
核酸复制（nucleicacidreplication）。
一旦宿主内核酸被转录和翻译（在RNA病毒情况中只有翻译），在新的噬菌体核酸指导下合成所需的酶。
有时这些称为早期蛋白，许多噬菌体切断宿主蛋白质合成和降解宿主的基因组，因此，保证所有细胞生物合成机构受噬菌体的基因组指令。
经过一个短时间之后，通常转换到产生大量噬菌体结构蛋白、噬菌体装配所需的支架蛋白和裂解及噬菌体释放所需的蛋白。
这些称为晚期蛋白。
噬菌体装配（Phageassembly）。
一旦噬菌体
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