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咖啡因的含量的测定论文

2011届攻读学士学位本科生毕业论文（设计）

测定氨咖黄敏片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量

学院中药学院

学生姓名代勤高

专业中药资源与开发

实习单位曲靖药业有限公司

导师姓名余鹏飞（执业药师）

二零一一年五月十四日

测定氨咖黄敏片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量

实习学生：

代勤高（2007级中药资源开发与利用班）

指导教师：

余鹏飞（执业药师、云南省曲靖药业有限公司）

郑方（工程师、化验室主任、云南省曲靖药业有限公司）

摘要:

其目的为用HPLC法对氨咖黄敏片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量同时进行测定。

其方法为采用DiamonisalC18（200mm×4.6mm，5um）色谱柱；以甲醇－水（40∶60）为流动相,流速为1.0mL/min,柱温为室温，检测波长为216nm,进样体积为20μL等条件下进行测定。

其结果为HPLC法测定表明，对乙酰氨基酚在0.3mg/mL~0.7mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9999；平均回收率=99.92%。

咖啡因在0.018mg/mL~0.042mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9998；平均回收率=99.74%。

其结论为高效液相色谱法（HPLC法）不仅能使对乙酰氨基酚和咖啡因更好地分离开来,提高了检测的专属性和准确度,而且操作简单迅速、结果准确可靠、重复性、稳定性良好，适用于氨咖黄敏片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量测定。

并且目前本法也被大多数制药企业应用于有效成分的分析与含量的测定。

关键词:

高效液相色谱法（HPLC法）；氨咖黄敏片；对乙酰氨基酚；咖啡因；测定含量；

引言

氨咖黄敏片是由对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏、人工牛黄制成的复方制剂。

常用于感冒引起的鼻塞、头痛、咽喉痛、发热等症状，是一种有效实惠的常用感冒药。

其处方中对乙酰氨基酚充当解热止痛药,被广泛应用于感冒药中[1]。

咖啡因是一种甲基黄嘿吟，是中枢神经刺激剂。

其药物学作用是影响大脑皮层、延髓和脊髓，刺激心肌，增加呼吸频率和深度，刺激肾上腺髓质释放肾上腺素，可兴奋大脑皮层,解除疲劳；并可使脑血管收缩,缓解脑血管扩张引起的头痛[2]等作用。

在本品中起到主导的作用与功效，因此被确定为检测的对象。

本品收载于国家药品标准[3]中。

该标准中采用指示剂滴定法分别对对乙酰氨基酚和咖啡因的含量进行测定。

其中对咖啡因含量采用加热回流提取后用外指示剂法滴定,操作繁琐，容易造成样品损失而使结果偏低；另外采用氯仿提取后滴定，毒性较大，挥发性强对实验工作者生命健康影响巨大；并且对滴定终点判断易受主观因素影响，测量误差较大[4-5]。

而高效液相色谱法能很好的弥补这一些缺点和不足发挥他自己的优点。

所以采用HPLC法同时对对乙酰氨基酚、咖啡因的含量进行测定。

操作简便、快速、重现性良好，使其含量测定结果准确可靠更符合客观实际。

[6-7]

1.实验材料

1.1实验仪器

岛津高效液相色谱仪LC－10ATVP泵；SIL－HTA自动进样器；SPD－M10AVP检测器；CLASS－VP色谱工作站；安捷伦1100高效液相色谱仪；BS－210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；HH.S－112型电热恒温水浴锅（江苏省医疗器械厂）；KQ－50B型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；滴定管等。

1.2实验试剂

甲醇为色谱纯（重庆川东化工有限公司化学试剂厂），稀硫酸（重庆川东化工有限公司化学试剂厂），稀盐酸（成都市欣海兴化工试剂厂），水为重蒸馏水，氯仿，硫代硫酸钠滴定液，亚硝酸钠滴定液等。

1.3实验药品

对乙酰氨基酚对照品和咖啡因对照品均由中国药品生物制品检定所提供。

氨咖黄敏片（批号：

051102、051107、051109、051110）由云南曲靖药业有限公司提供。

2.实验条件（色谱条件）　

色谱柱：

DiamonisalC18（200mm×4.6mm，5um）色谱柱；流动相：

甲醇－水（40:

60），流速为1.0mL/min，进样体积为20μL，柱温为室温，检测波长为216nm。

理论板数按对乙酰氨基酚峰计不少于5000，对乙酰氨基酚与咖啡因的分离度大于4。

并在计算机上设置好各项参数。

3.溶液配制

3.1对照品溶液的制备　

精密称定105℃干燥至恒重的咖啡因对照品30mg，精密加乙醇50mL使溶解，精密量取5mL，置50mL量瓶中并精密加入105℃干燥至恒重的对乙酰氨基酚对照品50mg使溶解，加水稀释至刻度，即得浓度为每mL含对乙酰氨基酚1mg和咖啡因0.06mg的对照品贮备液。

精密吸取上述溶液5mL置10mL量瓶中，加重蒸馏水稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，作为对照品溶液。

3.2供试品溶液的制备　

取氨咖黄敏片20片，研细，精密称取适量（约相当于对乙酰氨基酚200mg量），置于25mL锥形瓶瓶中，加流动相使之溶解，滤过，精密量取过滤液5mL置于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

3.3阴性对照溶液的制备

取不含对乙酰氨基酚和咖啡因的空白样品，照供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照溶液。

4.实验方法的考察[8-11]

4.1系统适应性试验

按上述色谱条件，分别吸取3.1、3.2、3.3项下溶液即对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20μL注入色谱柱。

采集色谱图（见a、b、c）。

a

b

c

氨咖黄敏片色谱图（图b、c中前锋为对乙酰氨基酚、后峰为咖啡因）

图a阴性对照溶液色谱图图b对照品溶液色谱图图c供试品溶液色谱图

由图a、b可知，阴性对照品色谱在对照品出峰位置上无干扰峰，即本试验条件下对测定干扰较小，系统误差较小。

又由图b、c可知，对照品图谱对乙酰氨基酚峰（Rt=4.532分钟）；咖啡因峰（Rt=6.583分钟）。

样品图谱对乙酰氨基酚峰（Rt=4.562分钟）；咖啡因峰（Rt=6.583分钟），且他们的分离效果都良好。

4.2线性关系考察（标准曲线的制作）

分别准确吸取浓度为1mg/mL的对乙酰氨基酚对照品溶液及浓度为0.06mg/mL的咖啡因对照品溶液各3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml分别置于10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得不同浓度的对照品溶液[12]。

吸取各浓度的对照品溶液分别进样20μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），进样浓度（mg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归。

同样也可以将（X1，Y1）、（X2，Y2）、（X3，Y3）、（X4，Y4）、（X5，Y5）各组数据输入计算机处理即可得相关参数[13]。

结果见表1

表1线性方程

成分回归方程（n=5）线性范围（mg/mL）相关系数

对乙酰氨基酚Y=8678.02X+113390.3~0.7r=0.9999

咖啡因Y=132.08X+27550.018~0.042r=0.9998

结果表明由相关系数（r）值很接近1表明对乙酰氨基酚在0.3mg/mL~0.7mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；咖啡因在0.018mg/mL~0.042mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

4.3精密度试验　

取对照品溶液20μL，按上述色谱条件，分别重复进样5次，结果对乙酰氨基酚的峰面积无显著差异，其平均值为16120：

其相对标准偏差RSD=0.20%，小于2%；咖啡因的峰面积无显著差异，其平均值为3440，其相对标准偏差RSD=0.31%，小于2%。

故本试验的精密度满足要求的规定。

4.4稳定性试验

取同一供试品溶液按上述色谱条件在2、4、6、8h进样20μL，测定峰面积及RSD，结果峰面积没有显著变化，相对标准偏差RSD=0.89%，小于2%。

表明样品溶液在8h内没有明显的变化是稳定的。

4.5重复性试验

取同一批号（051109）供试品，精密称取5份，按上述方法（3.2项的配法）制备供试品溶液，依上述色谱条件测定对乙酰氨基酚和咖啡因的平均含量及RSD。

结果见表2

表2

成分对乙酰氨基酚咖啡因

平均含量96.55%95.60%

RSD（n=5）0.40%0.46%

从表可知相对标准偏差值均小于2%可知本试验的重复性良好。

4.6加样回收率试验[14]

4.6.1采用加样回收法

精密称取已知含量的氨咖黄敏片（批号：

051109）适量（约相当于对乙酰氨基酚200mg）5份，置于50ml量瓶中，加流动相适量，振摇，溶解，再分别精密加入线性关系中的各对照品储备液5ml，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取过滤液2ml，置于25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。

按供试品测定项下的方法测定加样回收率，测得对乙酰氨基酚和咖啡因的加样回收率（n=5），结果见表3、表4。

表3供试品中对乙酰氨基酚回收率试验结果

试验供试品含量添加对照品量测得总量回收率平均回收率RSD

次数（mg）（mg）（mg）（%）（%）（n=5）

1200.415.00　205.39　　99.50

2200.185.00　205.19　100.12

3195.175.00　200.15　99.5699.920.36

4203.715.00　208.72　100.24

5200.825.00205.83100.20

表4供试品中咖啡因回收率试验结果

试验供试品含量添加对照品量测得总量回收率平均回收率RSD

次数（mg）（mg）（mg）（%）（%）（n=5）

111.900.3012.20　99.67

211.470.30　11.77100.33

311.980.3012.2899.3599.740.43

411.800.3012.10　99.35

511.770.3012.07　100.00

4.6.2回收率试验结果

回收率=加入对照品后的测得量—加入对照品前的量／对照品的量。

由上表结果表明HPLC法测定具有良好的回收率，说明系统误差小，本方法准确度高。

4.7供试品含量测定

4.7.1滴定法测定供试品中对乙酰氨基酚的含量

取本品20片，研细。

精密称取适量（约相当于对乙酰氨基酚200mg），加稀盐酸50mL，加热回流1小时，冷却至室温，加水50mL和溴化钾3g，将滴定管的下端插进液面下约2/3处，用亚硝酸钠（1.0mol/L）滴定液迅速滴定，随滴随摇，至近终点时，将滴定管的尖端提出液面，用少量水将尖端洗涤，洗液并进溶液中，继续缓缓滴定至用玻璃棒蘸取溶液少许，划过涂有含锌碘化钾淀粉指示剂的白瓷板上，即显蓝色的条痕时，停止滴定，五分钟后，再蘸取溶液少许划过一次，如仍显蓝色条痕，即为终点。

每毫升的亚硝酸钠滴定液相当于15.12mg的对乙酰氨基酚。

结果见表5。

4.7.2滴定法测定供试品中咖啡因的含量

精密称取上述细粉适量（约相当于咖啡因150mg）置于分液漏斗中，加稀硫酸20mL，振摇使之溶解，用氯仿提取4次（40mL、30mL、20mL、10mL），合并氯仿液，置于水浴上蒸干，残渣加稀硫酸30mL，加热回流1小时，放冷后移入100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀过滤。

精密量取过滤液40mL置100mL容量瓶中，精密加碘滴定液（0.1mol/L）50mL，用水稀释至刻度，摇匀，在约25℃避光放置15分钟，过滤，弃去初滤液。

精密量取过滤液50mL，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示剂2mL，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正即得。

每毫升碘滴定液（1mol/L）相当于5.305mg咖啡因。

结果见表6。

4.7.3用HPLC法测定氨咖黄敏片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量

取“3.1、3.2”项下溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，各按“2”项下色谱条件进样20μl测定，记录色谱，读取峰面积积分值，按外标法计算含量（标示量），咖啡因对照品为无水咖啡因（C8H10N4O2），分子量为194，样品中咖啡因含一分子的结晶水（C8H10N4O2·H2O），分子量为212，折算成含水咖啡因需乘以1.0927。

并与滴定法比较，结果详见表5、6。

表5滴定法和HPLC法测定氨咖黄敏片中对乙酰氨基酚含量

批号滴定法HPLC法

%%

05110296.7397.89

05110795.9198.73

0510997.8495.67

05111094.5296.79

表6滴定法和HPLC法测定氨咖黄敏片中咖啡因的含量

批号滴定法HPLC法

%%

05110294.3795.46

05110795.7894.67

05110996.7995.71

05111093.8894.57

4.7.4实验结果

从表6可知次批号的氨咖黄敏片中的对乙酰氨基酚和咖啡因含量均在规定范围中是合格的药品。

但是应用高效液相法（HPLC法）明显比滴定法简单方便快捷。

5.讨论

5.1对测定波长的选择

对乙酰氨基酚在流动相中的的最大吸收波长为246、199nm；咖啡因在流动相中的最大吸收波长为272、206nm。

考虑到本品处方中对乙酰氨基酚含量较大，咖啡因含量较小，而在216nm处两者均有较大的吸收。

故选择216nm为检测波长。

5.2流动相的选择

选择甲醇－水，比应用其他流动相安全经济实惠，又无盐溶液及酸碱性溶剂对色谱柱的损伤，且分离效果好。

5.3咖啡因含量的计算

咖啡因对照品为无水咖啡因（C8H10N4O2），分子量为194，样品中咖啡因含一分子的结晶水（C8H10N4O2·H2O），分子量为212，折算成含水咖啡因需乘以1.0927。

5.4试验安全性

咖啡因含量采用氯仿提取后滴定，操作也比较麻烦且氯仿毒性较大，挥发性强对实验工作者生命健康影响巨大。

5.5试验可靠性

国家药品标准采用样品回流后用滴定法测定咖啡因的含量，操作繁琐，容易造成样品的大量损失而使结果偏低且用外指示剂法指示终点误差较大，可靠性差。

5.6外标法

外标法又称标准曲线法，即依照测量标准品所绘制的曲线来测量被测供试品含量的方法。

其优点有简单、适合大量样品的分析而缺点是每次试验的色谱条件很难控制一致容易出现误差。

5.7试验结果

采用HPLC法对制剂中的对乙酰氨基酚和咖啡因进行含量测定，具有方法简便，灵敏度高的优点，与滴定法相比较，提高了测定的专属性和准确性，可用于氨咖黄敏片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量测定。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版（二部）[M].北京：

中国中国科技技术出版社，2010：

234

[2]王学锋，田玫.咖啡因的作用机理及对肌肉代谢运动能力的影响[J].山东休育学院学报.1995；4

[3]国家药品监管理局标准[S].WS－10001－（HD－0275）－2002：

259

[4]杨金凤，郭洪茹，马建成等.HPLC法测定氨咖黄敏胶囊中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量[J].河北化工.2008；31（7）

[5]盖轲，郑阿.利高效液相色谱法同时测定氨咖黄敏胶囊中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量[J].甘肃庆阳市药品检验所.2006;17（6）

[6]李立荣，肖冰梅，陈征等.HPLC测定感冒清中对乙酰氨基酚的含量[J].湖南中医学院.2001；23（3）

[7]侯小涛，谢东，周嵩煜.高效液相色谱法测定感冒灵冲剂中对乙酰氨基酚的含量[J].时珍国医国药.2004；15（12）：

812－813

[8]杨锁成，汪坤，张振凌.ＨＬＰＣ同时测定复方丹参降浊丸中丹参酮ⅡA和丹酚酸B[J].中国实验方剂学杂志.2011；17（9）：

84－86

[9]张翠玲，宋菲，李华玉.HPLC法测定复方感冒灵片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量[J].齐鲁药事.2004；25（50）：

28－29

[10]王荣，孙东坡.高效液相色谱法测定感冒灵冲剂中的对乙酰氨基酚含量[J].药学研究.2001；25（3）：

172－173

[11]韩超.高效液相色谱法测定白花前胡提取物中白花前甲素的含量[J].湖北中医大学学报.2011；13

（1）：

32－33

[12]牛恒立，陈凌，袁菲，等.复方山芪参胶囊的质量标准[J].中国药师.2007；10（5）

[13]黄世德，梁生望.分析化学[M].北京：

中国中医药出版社，2005：

15－16

[14]周嘉裕，汤佳，廖海，等.大黄、何首乌中大黄素和大黄酚的提取与含量测定[J].时珍国医国药.2008；19（5）

　　　　　　　　　　　　　　　　　感谢

感谢云南中医学院四年来的培养，感谢余老师对本论文从选题、构思、实验到最后定稿的各个环节给予细心的指引和教导，使我对于制药的一些只是有了一定的了解特别是在质量检验和控制方面得到了巨大的提高，并最终得以完成毕业论文，对此，我衷心感谢老师的教导和帮助。

同时也要感谢方老师在实验过程中给予的悉心指导。

感谢其他的员制员工在实习过程中给予的帮助。

老师们的高深精湛的造诣与严谨求实的治学精神将永远激励着我。

感谢云南省曲靖药业有限公司给我提供一个很好的实习机会。

在四年的大学生涯里，还得到众多老师的关心支持和帮助，在此，谨向老师们致以衷心的感谢和崇高的敬意!

在大学四年生活中，，不断得到各位老师、同学的关心与帮助，使我在学习和生活中不断得到友谊的温暖与关怀，最重要的是一种精神上的激励，让我非常感动。

感谢父母对我二十多年来辛勤的养育，并让我获取了一定的知识并最终走向社会，为社会贡献自己!

最后，我要向在百忙之中抽时间对本文进行审阅、评议和参加本人论文答辩的各位老师表示感谢！

代勤高

2011年5月13日