化妆品中7种染发剂的检测方法.docx
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化妆品中7种染发剂的检测方法
化妆品中7种染发剂的检测方法
（征求意见稿）
1适用范围
本方法规定了化妆品中酸性紫43（CAS：
224-618-7,CI42510）；碱性紫14（CAS：
632-99-5,CI42510）；酸性橙3（CAS：
228-921-5）；碱性黄87（CAS：
116844-55-4）；碱性蓝26（CAS：
2580-56-5,CI44045）；碱性红51（CAS：
12270-25-6）；碱性橙31（CAS：
97404-02-9）7种染发剂含量的高效液相色谱测定方法。
本方法适用于染发类和烫发类化妆品中碱性红51、碱性紫14、酸性紫43、碱性蓝26、碱性橙31、酸性橙3、碱性黄87等7种染发剂含量的测定。
2方法提要
试样经甲醇超声提取后，过0.45卬口滤膜，采用高效液相色谱系统分离，紫外检测器或二极管阵列检测器进行检测，外标法定量。
若取5.0g样品，本方法对碱性红51、碱性紫14的检出限为0.06mg/kg；酸性紫43、碱性蓝26的检出限为0.6mg/kg；碱性橙31、酸性橙3的检出限为L2mg/kg；碱性黄87的检出限为3.0mg/kg；最低定量浓度分别为：
碱性红51、碱性紫14：
0.2mg/kg＞酸性紫43、碱性蓝26为2.0mg/kg；碱性橙31、酸性橙3为3.5mg/kg；碱性黄87为lOmg/kgo
3试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为色谱纯，水为一级水。
3.1甲醇。
3.2四氢吠喃。
3.3乙酸铉：
分析纯。
3.4乙酸镀溶液（0.02mol/L）：
称取1.54g乙酸钱（3.3）,加水至1000mL,溶解，经0.45世1滤膜过滤。
3.5染发剂标准物质:
酸性紫43（AcidViolet43,CAS：
224-618-7,CI42510）；碱性紫14（BasicViolet14,CAS：
632-99-5,CI42510）；酸性橙3（AcidOrange3,CAS：
228-921-5）；碱性黄87（Basicyellow87,CAS：
116844-55-4）；碱性蓝26（BasicBlue26,CAS：
2580-56-5,CI44045）；碱性红51（Basicred51,CAS：
12270-25-6）；碱性橙31（Basicorange31,CAS：
97404-02-9）：
纯度均290%。
3.6染发剂混合标准储备液（1.0mg/mL）：
分别称取7种染发剂标准物质（3.5）0.1g
（精确至O.lmg）于100mL容量瓶中，甲醇（3.1）稀释定容。
3.7染发剂混合标准系列溶液：
分别移取一定量的2种染发剂（酸性紫43：
碱性紫14）标准储备液（3.6）,用中醇配制成浓度为5.0、10.0>20.0、30.0、40.0、50.0pg/niL的标准系列溶液；分别移取一定量的5种染发剂（酸性橙3；碱性黄87：
碱性蓝26；碱性红51；碱性橙31）标准储备液（3.6）,用甲醇配制成浓度为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0Rg/mL的标准系列溶液。
4仪器与设备
4.1高效液相色谱仪：
配紫外检测器或二极管阵列检测器。
4.2分析天平：
感量分别为0.1mg和1.0mgo
4.3超声波清洗器。
4.4涡旋混匀器。
4.5有机微孔滤膜：
0.45pm。
5分析步骤
5.1样品预处理
准确称取试样5.0g（精确至Img）于25ml比色管中，加入1.0ml四氢吠喃（3.2）,再力口入20ml甲醇（3.1）,涡旋振荡2min,在超声提取30min后,放置至室温,用甲醇（3.1）定容，摇匀，过0.45卜im滤膜，待测。
5.2色谱参考条件
色谱柱：
C18柱，250mmx4.6mm（内径），5卜un：
或相当者。
流动相：
A相（甲醇）+B相（0.02mol/L乙酸筱（pH=4.0））,梯度洗脱程序见表1。
流速：
1.0mL/min
柱温：
30°C
进样量：
IOrL
检测器：
紫外检测器或二极管阵列检测器
检测波长：
碱性蓝26为616nm；碱性红51、碱性紫14、酸性紫43为520nm；碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3为480nm。
表1梯度洗脱程序
时间，min流动相A（%）流动相B（%）
0595
103070
258020
358020
5.3测定
本方法采用外标校准曲线法定量测定。
以系列标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。
6计算
试样中染发剂的含量”喑信），按式
（1）计算：
式中：
W—试样中染发剂的含量，Ng/g；
C—试样溶液中染发剂的含量，卜唱/mL；
V—提取溶液体积，mL：
m一样品质量，go
7回收率和精密度
多家实验室验证的平均回收率为85.2%〜109.2%,相对标准偏差小于6%（n=6）o
8色谱图
图1在61611111下测得碱性蓝26标准高效液相色谱图
碱性蓝26标准出峰时间为30.389min
图2在520mn下测得碱性红51、碱性紫14、酸性紫43标准高效液相色谱图
标准出峰时间:
碱性红51为22.383min；碱性紫14为25.654min；酸性紫43为30.269
min
98re二O电SM—A
08
150020CO
图3在480nm下测得碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3标准高效液相色谱图
标准出峰时间：
酸性橙31为13.186min；碱性黄87为22.101min；酸性橙3为
29.437min
化妆品中7种染发剂的检测方法起草说明
为更好地服务化妆品安全监管，规范化妆品中禁限用物质检测技术要求，确保化妆品质量安全，2011年6月，国家食品药品监督管理局委托河北省保健食品化妆品协会开展《化妆品中7种染发剂的测定高效液相色谱法》方法建立和验证工作，现就起草工作有关情况说明如下：
一、起草的必要性
染发剂类化合物主要作用是增加化妆品的色泽，在染发剂等各类化妆品中最常使用的一类物质。
根据《化妆品卫生规范》2007版，染发剂属于限用物质或暂时允许使用染发剂目录，具体限量水平参见规范。
根据国内外报道，为了提升产品感官性能，部分企业超量使用染发剂，存在较大风险。
但是，当前仅有苯二胺等染发剂组分的检测技术要求，与现实生产实际使用种类相差较多，也不能涵盖当前现实使用的在规范目录以外的品种，成为行政监管的瓶颈问题，本技术要求的开发具有紧迫性和现实意义。
为此，需要建立有一种快速有效地检测化妆品中多种染发剂的方法。
本标准的制定宗旨在为化妆品中7种染发剂的测定提供更为准确的实验方法，有力的支撑未来市场化妆品的监管，同时也能够体现我国化妆品检测的水平和对化妆品监管的力度。
二、起草依据及文献
（-）《化妆品卫生规范》2007版.
（二）化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范.
（三）ThecosmeticDirectiveofCouncilEuropeanCommunities,76/768/EEC.
（四）《中国药典》2010版，第二部.
（五）李英、张琛.粉状化妆品中9种有机染发剂的高效液相色谱法测定，香精香料化妆品,2009,12（6）：
29-33.
（六）孙小颖、李英.高效液相色谱法同时测定化妆品中的9种水溶性染发剂，色谱，2009,27（6）：
852-855.
（七）郭桂媛、林维宣.高效液相色谱法同时测定化妆品中的4种禁用染发剂，日用化学工业,2011,41（3）：
229-231.
（八）RastogISC,BaiwickVJ.IdentificationoforganiccolorantsincosmeticsbyHPLC-Diodearraydetection.Chromatographic,1997,（45）:
215-228.
三、起草原则
本检测方法兼具先进性、准确性以及可操作性强的特点，采用目前一般检测实验室普遍具备的分析技术，选择适宜、可行、便于实际操作的分析条件，保证检测方法的精确性和重现性。
四、起草过程
依据国家食品药品监督管理局检验方法起草的有关要求，参考国家标准起草规范，该方法起草共分六个阶段：
1、任务下达。
2011年6月，正式获批开展《化妆品中7种染发剂的测定高效液相色谱法》方法建立和验证工作，项目组查阅了国内外相关技术标准和文献资料，调研了国内主要省区的行业情况；2、方法开发。
2012年5月，完成了该方法的建立工作；3、专家论证。
2012年6月，邀请食品、化妆品、质监等相关行业专家，对方法的可行性和实用性等技术指标以及资料完整性等进行了论证，专家一致认为该方法准确、简捷、可行，适用于作为标准化的检验方法；4、方法验证。
2012年7月，组织了方法验证单位（河北省药包材所、河北省疾控中心、河北出入境检验检疫局技术中心）的相关负责人和行业专家，召开了验证研讨会，介绍了检测方法建立过程、详细阐述了该方法的使用范围、原理、试剂材料、仪器设备、测定步骤等内容，并当场交接了验证技术资料、验证用标准品和样品。
三家验证单位按照签订的验证协议书要求，于8月底陆续将验证材料报送，将多家实验室方法验证材料进行总结和分析；5、审定会，2010年9月向国家食药监局上报全部项目材料，召开项目审定会，论证该方法的技术指标和文本材料等；6、修改报批。
根据审定会专家意见，对材料进一步补测完善，形成最终报批稿材料上报国家食药监局。
五、重点说明的问题
（-）关于体例。
本检测方法的体例主要参照现行2007版《化妆品卫生规范》的卫生化学检验方法的体例，便于化妆品检验领域相关检验人员的阅读和实际操作。
（二）关于7种染发剂。
见附页。
（三）关于检测方法的建立和验证。
经过对化妆品中7种染发剂样品前处理方法的选择，分析条件的优化，最终建立了化妆品中7种染发剂的液相色谱检测方法。
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图2在520nm下测得碱性红51、碱性紫14、酸性紫43标准高效液相色谱图
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图3在480ilm下测得碱性橙31、碱性黄87、酸性橙3标准高效液相色谱图
表17种染发剂的出峰时间表
染发剂名称
碱性红51
碱性紫
14
酸性紫43
碱性橙31
碱性黄87
碱性橙3
碱性蓝26
出峰时间（min）
22.383
25.654
30.269
13.186
22.101
29.437
30.389
方法验证表明，本方法中各种染发剂在一定线性范围内均有较好的线性相关系数（＞0.999）,具体见表2,7种染发剂的方法检出限见表3,在5.0mg/kg,50.0mg/kg两个添加水平时，提取回收率在85.5〜104.3%之间，方法回收在84.2〜99.5%之间。
日内精密度在0.83〜4.33%之间（n=6）,日间精密度在1.78〜5.39%之间（n=3）；日内（24h）和日间（5天）稳定性符合要求。
上述结果证实，本方法可以满足化妆品中7种染发剂的检测要求，并最终确定采用外标法计算样本中7种染发剂的含量。
三家实验室验证结果表明，回收率、精密度、标准曲线均符合要求，证实所建立方法可作为化妆品中7种染发剂的检测方法.
表2标准溶液标准曲线和线性范围
目标物质
线性范围
线性方程
线性相关系数
碱性蓝26
5〜100nig/L
Y=26OOOX-35OO
R=0.9998
酸性橙3
5〜100mg/L
Y=1240X+304
R=0.9989
碱性黄87
5〜100nig/L
Y=1030X+208
R=0.9982
碱性橙31
5〜100nig/L
Y=18400X-1920
R=0.9998
酸性紫43
5〜50mg/L
Y=2890X-938
R=0.9998
碱性紫14
5〜50mg/L
Y=23900X-14500
R=0.9999
碱性红51
5〜100mg/L
Y=21OOOX-7O8O
R=0.9999
表37种染发剂的检出限和定量限
染发剂名称
碱性红
51
碱性紫14
酸性紫43
碱性橙31
碱性黄87
酸性橙3
碱性蓝26
检出限（mg/kg）
0.06
0.06
0.6
1.2
3.0
1.2
0.6
定量限（mg/kg）
0.2
0.2
2.0
3.5
10
3.5
2.0
六、专家意见与反馈（会议时间：
2012年9月）
根据国家食品药品监督管理局保化司（以下称保化司）有关化妆品中禁限用物质检测方法委托工作的要求，河北省保健食品化妆品协会组织完成了化妆品中马来酸二乙酯、环氧乙烷、环氧丙烷、17种着色剂的检测方法研究。
并于2012年9月200,就上述检测方法，组织召开专家论证会。
与会专家认真听取了项目承担单位关于检测方法、编制说明、验证报告的汇报,审阅了检测方法，并进行了讨论，一致认为：
一、河北省保健食品化妆品协会建立的化妆品中马来酸二乙酯、环氧乙烷、环氧丙烷、17种着色剂的检测方法，基本满足现阶段化妆品中上述禁限用物质的检测要求。
二、检测方法的书写较规范、内容较全面。
与会专家对上述检测方法分别提出了具体修改建议。
建议项目承担单位按照本次会议意见，对化妆品中马来酸二乙酯、环氧乙烷、环氧丙烷、17种着色剂的检测方法，进行修改完善后报国家食品药品监督管理局保化司。
七、国家食药监局保化司组织专家论证会（2012年11月16日）
专家建议进一步补充完善后，提交国家食药监局保化司。
化妆品中7种染发剂的检测方法编制说明
第一部分基本信息
1简介
染发剂由于其功能性的作用，被广泛的应用于化妆品尤其是染发剂和烫发剂。
化妆品中使用的染发剂多数是化学合成，长期或过量使用都会对人体健康产生潜在的危害，有的染发剂会引起人的过敏反应，有的染发剂会引起皮肤发炎，还有的会透过皮肤被人体吸收，有明显的致突变作用，长期使用此类产品甚至可以诱发癌症。
为了安全起见，世界上很多国家对化妆品用染发剂做了法律性规定。
我国《化妆品卫生规范》中对化妆品用染发剂品种、使用范围和限制条件也都作了明确的规定。
目前对化妆品中常用染发剂的检测尚未形成完整和成熟的方法，非常不利于对化妆品市场的监管和管理。
本项旨在借助高效液相色谱法，建立化妆品中可能添加的染发剂类物质的检测方法。
同时为了保障化妆品质量安全，也为了化妆品中禁用物质行政监管和企业自检控制提供技术依据，特制定该批标准。
2属性信息
2.1碱性橙31
2.1.1中文名:
碱性橙31
2.1.2英文名称：
BASICORANGE31
2.1.3INC1名称:
BASICORANGE31
2.1.4分子式：
C11H14CIN5
2.1.5
分子量：
251.71536
2.1.6CAS号：
97404-02-9
2.1.7结构式：
2.1.8限定标准
《化妆品卫生规范》2007年版规定化妆品染发剂中最大允许使用浓度0.2%。
当与氧化乳混合使用时，最大使用浓度应为0.1%。
2.2碱性黄87
2.2.1中文名：
碱性黄87
2.2.2英文名称：
BasicYellow87
2.2.3
INCI名称：
Basicyellow87
2.2.4分子式：
C15H19N3O4S
2.2.5分子量：
337.39406
2.2.6CAS号：
116844-55-4
2.2.7结构式：
2.2.8限定标准
《化妆品卫生规范》2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：
0.2%。
当与氧化乳混合使用时.，最大使用浓度应为0.1%。
2.3碱性红51
2.3.1中文名：
碱性红51
2.3.2英文名称：
BASICRED51;
2.3.3INCI名称：
Basicred51/+CP
2.3.4分子式：
C14Hi8CIN5J
2.3.5分子量：
279.77
2.3.6CAS号：
12270-25-6
2.3.7结构式:
2.3.8限定标准
《化妆品卫生规范》2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：
0.2%。
当与氧化乳混合使用时，最大使用浓度应为0.1%。
2.4碱性紫14
2.4.1中文名：
碱性紫14,碱性品红
2.4.2英文名称：
FUCHSINBASIC
2.4.3INCI名称：
BasicViolet14
2.4.4
分子式：
C2OH2oC1N3
2.4.5分子量：
337.85
2.4.6CAS号：
632-99-5
2.4.7CI号：
CI42510
2.4.8结构式：
2.4.9限定标准
《化妆品卫生规范》2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：
0.3%。
当与氧化乳混合使用时，最大使用浓度应为0.15%。
2.4.10理化特性
黄绿色闪光结晶块状或砂状物。
溶于冷、热水中呈红紫色，极易溶于酒精中呈
红色。
遇浓硫酸呈黄棕色，稀释后几乎无色。
其水溶液加氢氧化钠液呈带有红色沉淀的几乎无色液体。
2.5酸性紫43
2.5.1中文名：
酸性紫43
2.5.2英文名称：
JAROCOLVIOLET43
2.5.3
INCI名称：
AcidViolet43
2.5.4分子式：
CziHuNNaOoS
2.5.5分子量：
431.39
2.5.6CAS号：
224-618-7
257cl号：
CI60730
2.5.8结构式：
2.5.9限定标准
《化妆品卫生规范》2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：
L0%。
当所用染发剂纯度不得＜80%,其杂质含量必须符合以下要求：
挥发性成分（135C）及氯化物和硫酸盐（以钠盐计）小于18%,水不溶物不得小于0.4%,1-羟基-9,10-慈二酮（1-hydroxy-9,10-anthracenedione）小于0.2%,p-甲苯胺（p-toluidine）小于0.1%,p-甲苯胺磺酸钠（p-tolluidinesulfonicacids,sodiumsalts）小于0.2%,其它染发剂（subsidiarycolors）小于1%,铅小于20mg/kg,伸小于3mg/kg,汞小于Img/kgo
2.5.10理化特性
溶于乙醇。
于浓硫酸中呈蓝色，稀释后呈橄榄棕色，并伴有紫色沉淀产生。
2.6酸性橙3
2.6.1中文名：
酸性橙3
2.6.2英文名称：
ACIDORANGE3263INCI名称：
AcidOrange3
2.6.4
分子式：
Ci8Hi3N4NaO7S
2.6.5分子量：
452.37319
266cAs号：
228-921-5
2.6.7结构式：
2.6.8限定标准
《化妆品卫生规范》2007年版规定在化妆品中最大允许使用量：
0.2%。
2.6.9理化特性
橙黄色粉末。
极易溶于冷水和热水中，在水中溶解度为50g/L（90C）,水溶液呈黄色。
易溶于乙醇，呈橙棕色。
于浓硫酸中呈黄色，稀释后转呈暗黄色，有沉淀产生。
2.7碱性蓝26
2.7.1中文名：
碱性蓝26
2.7.2英文名称：
BasicBlue26
2.7.3INCI名称：
BasicBlue26
2.7.4分子式：
C33H32CIN3
2.7.5分子量：
506.09「
276cAs号：
2580-56-5二一；二1二
2.7.7CI号：
CI44045WM._
2.7.8结构式：
2.7.9限定标准
《化妆品卫生规范》2007年版规定化妆品中最大允许使用浓度：
0.5%。
当与氧化乳混合使用时，最大使用浓度应为0.25%oo
2.7.10理化特性
深紫色（或灰绿色闪光）粉末。
溶于冷水、热水均呈蓝色。
溶于乙醇呈蓝色。
于浓硫酸中呈红光棕色，稀释后由黄变绿再变为蓝色。
于浓硝酸中呈橄榄绿色。
其水溶液加入氢氧化钠产生暗红棕色沉淀；加入盐酸产生蓝色沉淀。
第二部分方法选择与优化
1分析方法及其条件的选择与优化
1.1分析方法的选择
根据文献报道化妆品中染发剂适用于高效液相色谱分离与检测。
2007版《化妆品卫生规范》中只是规定了“化妆品组分中暂时允许使用的染发剂”的种类，并未对其方法进行限定。
目前国内外的检测方法有高效液相色谱-紫外可见检测法、高效液相色谱-串联质谱法及高效液相色谱-二极管阵列检测法等，本方法参考文献中有关染发剂含量的检测方法，确定了采用高效液相色谱-二极管阵列检测法。
1.2前处理优化实验
1.2.2提取溶剂选择
对于样品采用超声方式对样品进行提取，分别考察了乙醇、甲醇、乙胞、异丙醇-水（1:
1）以及四氢吠喃-水（1:
1）等多种提取溶剂对含有染发剂的加标样品测定结果的影响。
结果表明，中醇和四氢吠喃-水（体积比为1：
1）体系的提取效率相当。
考虑到四氢吠喃毒性较大，最终选择甲醇为最佳提取溶剂。
表1试样提取回收率实验结果汇总表
提取溶剂
添加浓度/mg/kg
回收率范围/%
RSD范围//%
乙醇
20.0
82.9〜93.8
0.68〜2.47
甲醇
20.0
92.1-99.2
1.52〜3.81
乙月青
20.0
78.9〜94.2
2.34〜5.41
异丙醇-水（1:
1）
20.0
74.8〜89.8
3.68〜4.47
四氢吠喃-水（1:
1）
20.0
91.3〜102.2
2.53〜3.395
1.2.1超声时间的优化
选择不同的提取时间（5,10,15,20,30,45,60min）进行实验。
结果表明,30min就可将样品中的染发剂类化合物提取完全，见图1。
图1不同提取时间的影响
1.3.1四氢吠喃的加入量
考虑到色淀的提取复杂性，加入一定量的四氢吠喃，促进提取的回收率。
四氢吠喃加入量分别为0.5、1.0、1.5、2.0,以碱性黄色淀为目标物，加入1.0ml四氢吠喃时，使用本方法测定其含量达到标称含量。
1.2定量方法的建立
1.2.1液相色谱条件的建立
甲醇是液相色谱常用的溶剂。
我们通过对不同浓度的中醇，0.02mol/L乙酸胺溶液进行对比实验，最终确定实验方案，结果表明甲醇（A）+0.02mol/L乙酸铁（B）梯度洗脱（见表1）时可以较好的分离目标物。
通常为保护色谱柱填料，选用流速为l.OmL/mino由于在该条件下，随柱温升高，会影响定性和定量准确度，故选用常温（25℃）作为色谱温度较为合适。
表2梯度洗脱程序
时间，min
流动相A（%）
流动相B（%）
0
5
95
10
30
70
25
80
20
35
80
20
1.2.2色谱柱的选择
实验比较了C18柱、C8柱和苯基柱对7种染发剂的分离效果及峰形，结果表明使用C18目标峰形尖锐，而且目标物与杂质能够完全分离，排除了基质的干
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